毕赤酵母表达人胰岛素前体的纯化和N末端不均一性分析

利用毕赤酵母生产人胰岛素前体时,在胰岛素前体的N末端引入一段由lO个氨基酸组成的间隔肽(EEAEAEAEPK)虽然可以提高目的产物的表达量,但间隔肽中的多个酶切位点有可能造成目的产物N末端的不均一性。对毕赤酵母分泌表达的胰岛素前体蛋白进行分离纯化,得到的样品经过MALDI-TOF-MS和N末端测序,证实了胰岛素前体N末端不均一性的现象,并对产生不均一性的原因进行了分析。实验同时证实,利用毕赤酵母得到的胰岛素前体,经胰蛋白酶酶切后,生成了B链缺少第30位苏氨酸但N末端均一的胰岛素产物desB30,且C末端未发生降解,这为人胰岛素和地特胰岛素的制备提供了新思路。     

应用2D-PAGE分析猪卵透明带抗原的酶解特性

猪卵透明带的来源相对比其他动物卵透明带丰富，又与人卵透明带有共同的抗原决定簇，是目前国内外卵透明带抗原研究的主要材料。寻找能诱发特异性阻止精卵结合的抗原组分是目前研究的重点。参与精卵相互作用的酶主要是透明质酸酶和顶体酶（类胰蛋白酶）。本研究拟通过ZD－PAGE图谱的改变分析胰蛋白酶和透明质酸酶对透明带抗原组分的影响，以及酶解过程中抗ZP血清所起的作用，为特异性抗原的分离纯化提供依据，并探讨ZP血清阻止精卵结合作用的机制。从实验结果可看出，透明带经酶处理后，尽管光学显微镜下尚未见任何变化，但ZD－PAGE…     

成年小鼠成纤维细胞体外培养

成年小鼠皮肤成纤维细胞可从尾部取材用组织块培养法进行原代培养,添加血清的M 199(E arle′s)和低糖的DM EM均能较好的满足原代细胞的生长.两种培养液中细胞增殖的速度无明显差异.用0.25%胰蛋白酶消化小鼠尾尖原代培养物,上皮细胞与成纤维细胞有明显的敏感度差别.经控温控时消化传代,可将上皮细胞与成纤维细胞分离纯化.     

广辟旦白饲料来沅

旦白饲料种类多,来沅广,对于发展大型饲养业非常重要。它既能节约粮食饲料,又能提供多种营养成分,成本低,收益大。一、酵母旦白饲料酵母是无毒优质旦白饲料,卵鸡日料加百分之二酵母,产旦率可达百分之九十五,平均卵重四十八点七克,比对照卵鸡节省百分之八点三饲料。国外用造纸、纺织废液发酵制取酵母。西德瓦尔特霍普公司早在四十年代就用造纸废液     

尿胰蛋白酶抑制剂纯化工艺研究

胰蛋白酶抑制剂是具有抑制胰蛋白酶作用的一类物质,可以调控生物体内多种生理反应,具有许多临床应用功能。采用大孔阴离子交换树脂吸附、硫铵沉淀、混合模式层析等纯化手段,成功从男性尿中分离纯化获得尿胰蛋白酶抑制剂,其生物活性达2 500 IU/mg,比活性达4 000 IU/mg·pr,活性回收率达75%。该纯化工艺具有步骤少、回收率高、产品纯度高等优点,适合于大规模生产。     

重组毕赤酵母植酸酶N-糖基化位点质谱鉴定

为系统评估重组毕赤酵母植酸酶的N-糖基化充分性,建立了一种通过联用高效液相色谱-串级质谱来分析植酸酶氨基酸序列及N-糖基化位点的技术.分别发酵了3株基因组已整合不同植酸酶基因的毕赤酵母.发酵液上清经离子交换与凝胶过滤后获得纯化的植酸酶.使用PNGase F或Endo H脱糖基化酶处理植酸酶后,用胰蛋白酶消化脱糖基化产物.通过纳升级高效液相色谱分离胰蛋白酶切产生的肽段混合物.并在联用的串级质谱上进行肽段测序与N-糖基化位点鉴定.结果显示3种植酸酶蛋白的可检测序列覆盖率均在69%以上,且与文献报道不同,均存在糖基化位点修饰不充分的现象.本实验结果证明了高效液相色谱-串级质谱联用法检测植酸酶N-糖基化位点的有效性,并为植酸酶的糖基化研究提供了新的基础.     

金属亲和层析法分离纯化醇脱氢酶

报道了用金属亲和层析法分离纯化酵母细胞中醇脱氢酶(ADH).以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂,乙二胺为螯合配基,制备了金属螯合亲和吸附剂.通过溶胀法从酵母细胞中抽提胞内酶,粗抽提液再经过硫酸铵盐析以及亲和柱层析.收得率为16.9%,纯化倍数达11.5.     

酵母醇脱氢酶的分离纯化

报道了酵母醇脱氢酶的分离纯化，使用硫酸铵分级沉淀，SephadexG—100凝胶层析技术，从啤酒酵母提取液中分离出醇脱氢酶，收得率为10．9％，纯化倍数达53．2。     

硒酵母制备中添加不同硒化物对酵母中硒含量的影响

进行了在麦芽汁培养液中添加亚硒酸钙、亚硒酸钠、二氧化硒等多种硒化合物制备硒酵母的研究．结果表明,酵母同化各种无机硒化物为有机硒的利用度不同,其中亚硒酸钙作为硒源具有毒性小、利用度高的特点．     

Q Sepharose F.F.层析柱的制备及BTI的初步纯化

通过对Q Sepharose F．F．离子柱的制备及荞麦蛋白酶抑制剂(BTI)的初步纯化，探索用自制层析柱代替价格昂贵的预装柱来分离纯化生物活性物质的可能性．实验结果表明：自制的Q Sepharose F．F．强阴离子层析柱可以满足对目的产品进行分离纯化的实验要求，同时与购买的预装柱比较，自装柱具有较大的上样量，柱体积灵活可变以及低成本等特点．     

人脂联素在大肠杆菌中的可溶性表达

为了提高重组人脂联素在大肠杆菌中的可溶性,构建和表达了增溶标签与人脂联素的融合表达栽体.这些标签包括大肠杆茵硫氧还蛋白和NusA蛋白、酿酒酵母SUMO蛋白和噬热海洋茵Thermotoga maritime 的红素氧还蛋白.结果显示,所有的人脂联素融合蛋白在大肠杆茵中都获得了高水平的表达,但可溶性存在很大差异,说明不同融合标签对人脂联素可溶性表达的促进作用不同.其中,红素氧还蛋白与SUMO蛋白组合一起对人脂联素可溶性的增强作用最为显著,其相应的融合蛋白几乎全部可溶.另外,通过酵母SUMO/Ulp1反应,经His标签亲和层析纯化得到的人脂联素融合蛋白能被有效酶切,加工为人脂联素成熟肽产物.     

猪血浆巯基蛋白酶抑制剂的分离纯化及性质研究

用(NH_4)_2SO_4分段盐析,DEAE-纤维素离子交换和Papain—Sepharose亲和层析,从猪血浆纯化了一种巯基蛋白酶抑制剂(SUlfhydryl proteinase inhibitor;简称SPI);纯化倍数为54.36倍.经高pH、低PH不连续电泳呈一条区带.含糖量为7.77％;PI为4.80.氨基酸组成分析表明,猪血SPI富含酸性氨基酸、芳香族氨基酸和含硫氨基酸.用SDS-PAGE和SephadexG-100层析,测得分子量为130000d和131000d,由两个分子量略有差别的亚基组成.对木瓜蛋白酶有强烈抑制作用,对胰蛋白酶无作用。α-螺旋结构含量高。     

章鱼内脏胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与性质研究

通过热处理、硫酸铵盐析、膜超滤及SP-Sepharose 离子交换层析,从章鱼内脏中纯化得到一种胰蛋白酶抑制剂 (Octopus Trypsin Inhibitor ,OTI)．Tricine-SDS-PAGE 电泳结果显示,OTI的分子质量约为6500 u．性质分析结果表明:OTI在pH=1.0~11.0缓冲液中孵育30 min,抑制活性稳定;在100 ℃下加热1 h、2 h 后仍分别具有90% 和65% 的抑制活性,具有良好的pH值稳定性和热稳定性;OTI能够显著抑制胰蛋白酶的活性,对胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶几乎无抑制活性;OTI能够有效抑制蓝圆鲹肌肉中肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶 (MBSP) 引起的肌球蛋白降解．     

重组绿豆胰蛋白酶抑制剂片段对肠癌细胞SW480迁移的影响

探讨重组胰蛋白酶抑制剂活性片段(LysGP33)的抗肠癌效应.大肠杆菌原核表达LysGP33活性片段,GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化.MTT比色和细胞划痕方法检测LysGP33活性片段对SW480细胞增殖和迁移的影响.结果表明:10 μmol/L LysGP33活性片段对SW480细胞的增殖活性无明显影响,但能够有效地抑制SW480细胞的迁移,并呈现时间依赖效应.绿豆胰蛋白酶抑制剂抑制了肠癌细胞的迁移,在抗肿瘤浸润和转移中具有一定的应用前景.     

藻红蓝蛋白连接/异构酶重组体系

把层理鞭枝藻藻红蓝蛋白操纵子A，E和F基因分别克隆在表达载体pET30中，转入大肠杆菌表达了相应蛋白质，利用pET3载体表达的蛋白质具有6个连续组氨酸亲和标记，用Ni^2 螯合亲和层析柱提纯了表达的蛋白质，用这些纯化的蛋白质建立了藻红蓝蛋白α亚基体外重组系统，从而证明藻红蓝蛋白操作子E和F基因编码层鞭枝藻红蓝蛋白为连接／异构酶。     

PMEPA1蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

为了从蛋白水平上检测前列腺跨膜蛋白PMEPA1(prostate transmembrane protain,androgen induced 1)在细胞内的表达和功能,构建了原核表达重组质粒pTrcHisA-PMEPA1和pGEX4T-2-PMEPA1,转化大肠杆菌BL21-RIPL后,IPTG诱导蛋白表达,分别用Ni-NTA和谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白。用His-PMEPA1免疫兔子制备抗体,并用GST-PMEPA1对抗体进行纯化。免疫印迹检测显示抗体能够特异识别细胞中内源PMEPA1蛋白。     

嗜热厌氧产乙醇杆菌乙醇代谢途径的初步研究

以乙醇产量和细胞密度的提高为目标,从碳源和氮源入手,对嗜热厌氧产乙醇杆菌THermoanaerobacter ethanolicus JW200的培养基作了初步优化以提高乙醇代谢途径中的关键酶的得率,便于提纯.葡萄糖浓度的提高对乙醇的产生有明显的诱导作用,但当葡萄糖浓度高于2%,乙醇产量反而下降.酵母粉对乙醇产量没有促进作用,单纯提高酵母粉浓度对细胞密度无显著影响,而同时提高葡萄糖和酵母粉浓度至2.0%,OD600最高可达2.0.2%葡萄糖,0.5%酵母粉对单位细胞乙醇产量的诱导效果最佳.T.ethanolicusJW200粗酶液中未检测到丙酮酸脱羧酶的活性,经亲和柱Cibacron Blue-3GA部分纯化,在NAD洗脱蛋白中检测到辅酶A依赖型乙醛脱氢酶的活性,表明辅酶A依赖型乙醛脱氢酶是该菌乙醇代谢途径中的关键酶,它和乙醇脱氢酶共同作用,将乙酰辅酶A转化成乙醇.     

禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达

目的克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶基因（neuramidinase,NA）序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA（49～1 587 bp）、pMET A/NA（121～1 200 bp）,电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了依据。     

人尿胰酶抑制剂部分生化性质

用自制人尿胰酶抑制剂（HUTI）,研究了它的部分生物化学性质。经HPLC和凝胶排阻层析表明,纯HUTI的表观分子量与牛血清白蛋白相当,约为66kD。然而,10％SDS－PAGE分析表明,它的分子量约为40kD,这一差异可能与蛋白分子具有高含量 的糖链有关。另外,对HUTI的氨基酸组成、糖含量和抑制类型等亦进行了研究。