嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

首先通过引物设计扩增嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶基因,然后采用Not I和Xho I双酶切目的基因与载体pPICZα-A,通过T4连接酶连接后转化DH5α菌株,挑取阳性克隆进行测序,测序正确阳性克隆放大培养,大量提取质粒,并采用限制性内切酶Sac I线性化质粒,电转化感受态酵母细胞,经培养后挑选转化子分别对应点种到MM、MD平板,并利用ZeocinTM获得多拷贝重组子,最后经甲醇诱导,并于48、54 h取样,经SDS-PAGE分析,结果表明整合嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶的毕赤酶母工程菌株构建成功.     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列设计引物,以pHBM102为模板,扩增得到β-1,4-内切葡聚糖酶GluD基因片段,克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pHBM905上,获得重组毕赤酵母表达载体pHBM905D,将此质粒分别转化毕赤酵母GS115,KM71和SMD1168菌株,筛选获得GS115(pHBM905D),KM71(pHBM905D),和SMD1168(pHBM905D),平板诱导培养表明,GS115(pHBM905D)所产生的水解圈最大,酶活力最高.摇瓶诱导培养,表达β-1,4-内切葡聚糖酶,此酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值6.4,在诱导8 d后酶活力达到最高为0.185 8 U/mL.     

大黄鱼与美国红鱼抗菌肽Piscidin串联基因的构建、酵母表达及抗菌活性鉴定

采用Piscidin基因串联表达的方案,通过Eco31Ⅰ限制性内切酶定向连接方法合成Pseudosciaena crocea-Sciaenops ocellatus-piscidin (PSP)串联基因.以毕赤酵母(Pichia pastoris)的穿梭表达载体pPICZαA构建重组表达质粒pPICZαA-PSP,转化入毕赤酵母SMD1168菌株中.应用实时荧光定量PCR方法进行多拷贝克隆筛选,实现了PSP重组串联肽的诱导表达和纯化,并对其抑菌活性进行初步鉴定,为piscidin抗菌肽的生产应用奠定基础.     

纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

构建pPICZαA-NK重组质粒，并转化入E.coli TOP-10中，得到转纳豆激酶基因工程菌，提取重组质粒经单酶切，双酶切，PCR分析及序列测定，证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因，将重组质粒pPICZαA-NK线性化后，分别转化毕赤酵母GS115与KM71，在含Zeocin^TM的选择性YEPD平板筛选到重组酵母，经检测重组酵母发酵上清液中具纳豆激酶溶纤活性，SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%左右。     

α-葡聚糖酶在毕赤酵母中的组成型表达

为避免α-葡聚糖造成的制糖过程中的糖分损失、制炼难度增加以及糖产品质量下降,利用α-葡聚糖酶分解而直接去除α-葡聚糖是目前最佳的选择.文中扩增了α-葡聚糖酶基因dex,构建组成型表达载体pGAPZαA-dex;以毕赤酵母KM71H为受体菌,将表达载体整合进入受体菌基因组,构建了组成型表达α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌.摇瓶发酵120h,α-葡聚糖酶酶活达到60.4U/mL,从而实现了α-葡聚糖酶在毕赤酵母中的组成型表达,使发酵过程无需使用甲醇进行诱导,提高了生产和使用安全性.     

共表达鸡IBDV VP2和IL-2基因的重组毕赤酵母的构建及免疫原性

通过重叠延伸PCR扩增IL2-VP2串联基因,克隆到pMD18-T载体上,亚克隆正向插入到毕赤酵母表达质粒pPICZαA中,经PCR和双酶切鉴定表明成功构建了酵母重组表达载体pPICZαA-IL2-VP2。将该重组质粒线性化后电击转化入感受态毕赤酵母X-33菌株,构建成分泌型表达IL2-VP2的酵母工程菌株。经甲醇诱导后,通过SDS-PAGE、Western-blot活性检测分析表明IL2-VP2基因长度为1.85kb,包含缺失了TAA终止密码子的IL-2基因和缺失了ATG起始密码子的VP2基因,两个基因之间以高度柔韧性的(Gly-Gly-Gly-Ser)编码核苷酸相连接,并在该体系中得到分泌表达,分子量约为50kD,且表达产物对传染性法囊病毒具有较好的反应原性。     

重组人卵ZP3肽段在毕赤酵母中的表达

目的:用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达人透明带hZP3片段,研究其抗生育作用.方法:设计特定引物从hZP3全长序列中PCR扩增794～1282nt基因片段,将扩增片段克隆到酵母表达载体pPICZα上, 构建成重组质粒pPICZα-hZP3CT,线性化后的重组质粒导入毕赤酵母中,筛选出高拷贝菌株,甲醇诱导目的蛋白表达.用SDS-PAGE 和Western blotting 分析表达产物.结果:成功构建酵母表达载体,并在酵母菌株X-33中诱导表达重组蛋白.重组蛋白可以与鼠抗重组人卵透明带hZP3融合肽段的抗血清发生特异结合,表明目的基因成功表达.结论:重组hZP3蛋白已在酵母中成功表达,目的蛋白能与相应的抗体结合.     

汉坦病毒囊膜糖蛋白G2在毕赤酵母GS115中的表达及鉴定

构建了编码汉坦病毒囊膜糖蛋白G2基因的重组质粒,在毕赤酵母中表达,为汉坦病毒基因工程疫苗的研究提供实验基础。利用PCR法从含汉滩病毒76-118株M基因的M56质粒中扩增编码糖蛋白G2的基因片段,克隆入酵母分泌表达载体pPICZαA,构建重组质粒pPICZαA-G2。酶切鉴定挑取的阳性克隆,转化入GS115工程菌,在含100μg/mLZeocin的YPD培养基上筛选。挑选单菌落,PCR鉴定阳性克隆,用0.5%甲醇诱导表达,并利用SDS-PAGE及Western-Blot鉴定表达产物。序列分析表明所获得的基因片段与编码汉滩病毒76-118株囊膜糖蛋白G2的基因一致;100μg/mLZeocinYPD培养基上筛选出含pPICZαA-G2转化子,PCR鉴定为阳性克隆;SDS-PAGE可见约70kDa处有目的蛋白表达条带,经Western-Blot证实该条带为汉滩病毒囊膜糖蛋白G2。成功地构建了重组酵母表达载体pPICZαA-G2,并在毕赤酵母中初步表达成功,为今后汉坦病毒囊膜糖蛋白G2表达纯化以及基因工程疫苗的制备奠定了一定基础。     

人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达

以PCR方法扩增人bsp基因，与分泌型表达载体pPICZαA重组，重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株，获得的GS115／pPICZαA－hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明，产物的分子质量接近66ku，能发生特异性抗原－抗体反应。     

匍枝根霉内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的克隆及表达

从匍枝根霉TP-02的cDNA文库中克隆得到其内切葡聚糖酶基因,并在毕赤酵母中进行表达.该内切葡聚糖酶基因大小为954bp,将其与pPIC9K质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,利用T4连接酶进行连接.将线性化后的重组质粒转化毕赤酵母GS115,并利用MD平板和刚果红平板进行筛选.阳性克隆经甲醇诱导培养84h后,产生的内切葡聚糖酶酶活力达到峰值为1.754IU/mL.