GST-Jab1融合蛋白表达载体的构建及表达纯化

目的获取GST-Jab1蛋白,进一步研究Jab1的功能。方法以pMSCVneo-Jab1为模板,PCR扩增Jab1 DNA片断,EcoRI和XhoI双酶切后克隆至pGEX-5X-1表达载体,测序验证。将正确重组的pGEX-5X-1-Jab1表达质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导后,超声破碎细胞,用GST琼脂糖珠对上述表达产物进行纯化,SDS-PAGE、Western Blot分析和鉴定诱导表达和纯化的GST-Jab1蛋白质。结果成功构建了pGEX-5X-1-Jab1重组表达载体,SDS-PAGE分析结果显示表达和纯化的蛋白质与融合蛋白GST-Jab1预期分子量一致,Western Blot鉴定结果证实纯化的蛋白质为GST-Jab1。结论成功地表达、纯化了GST-Jab1融合蛋白。     

δ-氨基-γ-酮戊酸合成酶(ALAS)基因的克隆与原核表达

为获得ALAS的重组表达蛋白,以人肝脏组织cDNA为模板,通过PCR扩增得到ALAS全长片段并测序,成功构建了pET30a(+)-ALAS融合表达载体并转化大肠杆菌Rosetta(DE).IPTG诱导融合蛋白表达.SDS变性凝胶电泳结果显示,融合蛋白的分子量约70kDa,并且在上清液中有少量表达.经镍柱一步纯化得到His6-ALAS融合蛋白.     

Myostatin基因原核表达载体的构建及蛋白表达、纯化与鉴定

应用基因工程技术,将合成Myostatin C-末端区(330bp)的基因序列,克隆至原核表达载体pQE30,以构建人的Myostatin基因原核表达载体.构建的重组质粒pQE-Ms转染大肠杆菌宿主菌DH5α后,IPTG诱导表达重组蛋白.应用SDS-PAGE电泳和Western Blot分析和鉴定了重组蛋白的特异性,并用镍离子亲和色谱柱层析进行目的蛋白的纯化与鉴定.结果表明:重组质粒pQE-Ms酶切和测序结果与预期相符,SDS-PAGE电泳和Western Blot证实表达蛋白为目的蛋白,蛋白表达形式为包涵体,经镍离子螯合亲和层析柱纯化及鉴定,确定实验获得了高纯度的目的蛋白,为人体血清中Myostatin蛋白表达的检测及特异性抗体制备等研究提供了实验依据.     

NF-κB相互作用多肽原核表达载体的构建、表达与纯化

为了获得高纯度的可溶性NF-κB相互作用多肽,首先以酵母双杂交技术筛选获得的NF-κB相互作用多肽的酵母表达质粒pGAD GH/pp10为模板,扩增多肽基因片段,后经BglⅡ,StuⅠ双酶切后连接到pET-42a(+)载体中,构建GST/多肽融合蛋白的原核表达载体,并将GST/多肽融合蛋白的原核表达载体转化入BL-21菌株,用0.4 mmol/L IPTG于30 ℃诱导表达4 h,后经GST亲和纯化GST/多肽融合蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白的表达和纯度.实验结果表明,成功地构建了NF-κB相互作用多肽的GST/多肽融合蛋白原核表达载体,进行了GST/多肽融合蛋白的诱导表达,融合蛋白的表达为可溶性表达,最终纯化获得纯度约为80%的可溶性GST/多肽融合蛋白,这将为后继利用GST pull-down,Bio-sensor,EMSA等实验进一步验证NF-κB相互作用多肽的功能提供可靠的材料来源奠定基础.     

鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.     

棉花脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆、原核表达与纯化

为进一步探讨脱氢抗坏血酸还原酶的生物学功能,克隆棉花的脱氢抗坏血酸还原酶基因,对该基因进行了原核表达,并对重组蛋白进行纯化和分析。通过RT-PCR方法扩增脱氢抗坏血酸还原酶基因全长,利用BamH I和Xhol I酶切位点将其克隆至组氨酸(histidine,His)融合蛋白表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经异丙基硫代--βD-半乳糖苷(isopropy--βD-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物,并用亲和层析柱纯化重组表达的pET28a-DHAR蛋白。结果表明:重组体PET28a-DHAR经测序和酶切鉴定证实构建成功。导入大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE分析目的蛋白高效表达,相对分子量为26 kD左右,并获得了纯化的His-DHAR融合蛋白。     

丙型肝炎病毒截短型核心C区和NS_3区融合蛋白(C_8-NS_3)的原核表达

通过RT-PCR从HCV全长基因组中分别克隆HCV核心区和NS3非结构区的部分优势表面抗原的基因片段,运用重叠延伸PCR技术将它们拼接成融合基因,将融合基因再克隆到表达载体pTrcHis2 TOPO TA中,转化大肠杆菌Top10,阳性克隆经IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经15%SDS-PAGE鉴定,重组蛋白经His标签纯化.经IPTG诱导可高效表达分子量约为14.4KD的融合抗原,重组蛋白主要以可溶性形式存在.经过纯化目的蛋白纯度达96.3%以上的,表达量约为550μg/mL.ELISA结果表明纯化蛋白具有良好的抗原性.     

家蚕抗菌肽CM4和人可溶性BAFF融合基因的克隆、表达及活性鉴定

采用PCR法从含有人可溶性BAFF基因的pET30a( )扩增得到人sBAFF基因,通过rPCR将抗菌肽Cecropin CM4基因的2条单核苷酸链进行扩增得到CM4基因,再采用over-lap PCR法通过linker将hsBAFF与Cecropin CM4融合基因相连接.经纯化和鉴定后,定向插入到原核表达载体pET30a( )中,然后转化E.coliBL21(DE3),通过实验确定了表达该融合基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为1.0 mmol/L,诱导时间为5 h.温度为30℃,其表达量占全菌蛋白的40%.表达产物经SDS-PAGE分析,得到相对分子质量约为22 000的重组蛋白并且存在超声裂解后的上清中.重组蛋白经Western blot检测,结果显示重组蛋白可被鼠抗人可溶性BAFF的抗体识别.采用分子筛Sephadex G-75对重组融合蛋白进行纯化,并经SDS-PAGE对其鉴定.通过对其生物学功能的检测得知,纯化后的重组融合蛋白对大肠杆菌K12D31和真菌有明显的抑菌能力.     

酿酒酵母金属硫蛋白的表达、纯化及活性检测

通过PCR从酿酒酵母基因组DNA上扩增得到酿酒酵母基因CUP1编码的金属硫蛋白序列.将其编码序列克隆到质粒pTWIN1构建重组表达质粒pTWIN1-MT,转化大肠杆菌感受态细胞ER2566.重组融合蛋白CBD-intein1-MT在IPTG的诱导下得到表达,经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定.用重组菌分别进行铜离子耐受...     

麻疯树小热激蛋白JcHSP-17.5的纯化与活性鉴定

将实验室已有的pET32a-JcHSP17.5重组载体,经测序验证后,转入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中,不同温度条件下,用不同浓度异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,优化表达条件;选择镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化JcHSP-17.5蛋白,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度;通过热激聚合反应来鉴定蛋白的分子伴侣活性.结果表明,17℃,200r/min,0.5mM IPTG诱导13h为JcHSP-17.5蛋白的最佳诱导表达条件,使用200mmol/L咪唑缓冲液纯化蛋白后,每500mL菌液可得到1.345mg的电泳纯蛋白,该蛋白在高温(45℃)条件下能够阻止苹果酸脱氢酶(MDH)发生聚合反应,表现出较强的分子伴侣活性.     

GST-SDF-1α融合蛋白的原核表达及纯化

构建融合重组表达载体并对其进行诱导表达蛋白以获得大量重组融合蛋白。通过PCR方法扩增出小鼠SDF-1α基因,克隆入pMD18T载体中,进行测序分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T11中GST的下游构建重组质粒pGEX-4T1-SDF-1α,转化受态细胞BL21中,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测分析。在约Mr36×103处出现一新生的蛋白条带。经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后得到了目的蛋白。成功克隆了小鼠的SDF-1α基因,并纯化融合基因GST-SDF-1α的原核表达产物。     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中, 经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株. 该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的23%. 包涵体经洗涤和溶解， 在变性条件下利用Ni²⁺螯合柱纯化、 尿素梯度复性后， 得到纯度达98%以上的纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 ０００， Western-b lot分析表明， 在相应分子量处有一特异性条带， 说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.     

GST和His标记的重组蛋白制备及吸附纳米ZnO的研究

以pET-28a(+)载体为模板人工设计引物,通过PCR反应扩增带有质粒上游6聚组氨酸(6×Histidine)序列的目的基因片段,克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,筛选及鉴定阳性重组子pGEX-His,转化E.coli BL21细胞后通过IPTG诱导表达.由谷胱甘肽(GST)和6聚组氨酸标记的重组蛋白GST-His得到表达,利用Ni-NTA系统进行纯化.通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析鉴定,由LC-MS/MS质谱分析确定所得蛋白为目标产物.通过蛋白结合纳米无机材料的亲和吸附实验结果证实,重组的新蛋白表现出对纳米ZnO特异吸附的生物活性.     

蜂毒素-SP94杂合基因原核表达载体的构建及蛋白纯化

用可以特异结合到肝癌细胞膜上的小肽SP94,与蜂毒素连接,构建重组表达载体pET32a-蜂毒素-SP94.转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达结果,产物经Ni-NTA Agrosc亲和层析柱纯化后进行Tricine-SDS-PAGE检测.重组蛋白在大肠杆菌中高效表达,约占细胞总蛋白...     

重组人脂联素基因构建、表达、纯化及活性鉴定

根据脂联素cDNA序列设计并合成9条寡聚核苷酸片段,经重叠PCR技术获得重组人脂联素基因.构建pET-22b( )/ADPN表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上.表达产物通过Ni-NTA柱纯化,SDS-PAGE分析显示,其分子量约为30 ku,与预期结果一致.内皮细胞生长抑制实验证实,重组人脂联素生理浓度下具有抑制人内皮细胞生长的活性并呈时间依赖性.以上工作为进一步研究脂联素的生物学功能奠定了基础.     

带有TAT-PTD跨膜转导域融合基因的原核表达及表达条件优化

为构建pGEX-TAT-GFP原核表达质粒并优化GST-TAT-GFP表达条件,将PCR扩增的基因TAT-GFP克隆至质粒pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并优化表达条件,表达产物进行SDS-PAGE、Western blot及荧光学特性鉴定.结果表明:构建的质粒经PCR、酶切和DNA测序正确,含有重组质粒的宿主菌经过IPTG诱导表达分子量约为54.3 kD的融合蛋白GST-TAT-GFP,并经优化确定最佳的诱导表达条件.     

细粒棘球绦虫重组pET30a-EgA31疫苗的构建和诱导表达

克隆细粒棘球绦虫EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析.从细粒棘球绦虫成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板RT-PCR 克隆获得EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E coli DH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆.IPTG初步诱导和表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平.测序表明选取的pET30a-EgA31阳性克隆均为正确连接EgA31抗原基因的重组质粒.经IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约为31 kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%.成功克隆并构建了pET30a-EgA31原核表达质粒.初步诱导表达出EgA31重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础.     

人TCTP基因的克隆与原核表达

人翻译控制肿瘤蛋白（hTCTP）是一个在进化过程中高度保守且具有很高表达量的蛋白家族。本实验通过PCR技术扩增人hTCTP基因,经酶切后插入表达质粒pGEX-4T-2构建表达载体,转化大肠杆菌后挑选阳性菌进行菌落PCR及质粒酶切鉴定,确证克隆成功并构建了人hTCTP基因表达载体。重组表达载体经IPTG诱导表达出目的蛋白,用超声破碎、亲和层析和SDS-PAGE对目的蛋白进行了分离纯化并鉴定。     

PP2A B56α调节亚基原核表达载体的构建及表达

为了构建PP2A B56α调节亚基原核表达载体,以p CEP-4HA-B56α质粒为模板,设计引物克隆人源PP2A B56αc DNA,连入p GEX-4T-1载体中,测序正确后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,对可溶性蛋白进行纯化.SDS-PAGE电泳及Western Blot分析鉴定重组蛋白.结果表明,经测序和酶切鉴定后成功构建重组质粒p GEX-4T-1-B56α,表达大小约79 k D的重组蛋白,可溶性表达的重组蛋白为菌体总蛋白质量的8.6%,经GST纯化系统纯化得到纯度约为78.9%的重组蛋白,回收率达到52.2%.因此,本研究成功构建了PP2A B56α原核表达体系,获得重组蛋白,为研究PP2A B56α的生物学功能奠定了基础.     

人CDK4基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

将人CDK4基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中, 经 酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28a-CDK4, 转化E.coliBL21(DE3)后获得表达菌株. 该表达菌株经IPTG诱导后, 高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的52.6%, 包涵体经过洗涤、 尿素变性溶解、 His Trap HP Kit柱纯化、 稀释复性, 获得纯度达98%以上的蛋白. SDS-PAGE及Western blot分析表明, 在分子量34 000处有一特异性蛋白条带. 结果表明, 已成功的表达和纯化纯度达98%的重组人CDK4蛋白.