人FOXA1蛋白的原核表达、纯化及蛋白互作分析

构建FOXA1的原核表达载体,诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段,为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA,逆转录成cDNA,设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段,分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21Rosetta DE3,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育,进行GST-Pull down试验,检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX-4T-1-FOXA1-C和pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表达载体;在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C与N端蛋白片段GSTFOXA1-N;证实GST-FOXA1-C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.     

Abd-Bcr/Abl原核表达载体的构建和表达

构建Bcr/Abl-Abd原核表达载体,并表达、观察对白血病细胞K562的影响.以慢性白血病PGD210质粒为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增出Abd编码区序列,克隆入pMD18t载体,经酶切测序鉴定正确.再通过酶切重组克隆入原核表达载体pET32a,构建pET32a-Abd重组表达质粒,经酶切、测序鉴定,序列、读码框均正确.通过转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,纯化.结果PCR扩增出特异性的501bp的目的片断,以此构建的重组质粒pET32a-Abd能够在上清中表达约36.6 kd的目的蛋白,Westem blot鉴定为特异表达.证明成功构建了原核表达载体pE732a-Abd,并表达在上清中,表达蛋白约占菌体总蛋白的6%,纯化后达到74.3%,Westem blot检测为特异性表达,为进一步研究该蛋白对慢性白血病细胞的作用奠定了分子基础.     

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.     

GST-SDF-1α融合蛋白的原核表达及纯化

构建融合重组表达载体并对其进行诱导表达蛋白以获得大量重组融合蛋白。通过PCR方法扩增出小鼠SDF-1α基因,克隆入pMD18T载体中,进行测序分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T11中GST的下游构建重组质粒pGEX-4T1-SDF-1α,转化受态细胞BL21中,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测分析。在约Mr36×103处出现一新生的蛋白条带。经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后得到了目的蛋白。成功克隆了小鼠的SDF-1α基因,并纯化融合基因GST-SDF-1α的原核表达产物。     

Myostatin基因原核表达载体的构建及蛋白表达、纯化与鉴定

应用基因工程技术,将合成Myostatin C-末端区(330bp)的基因序列,克隆至原核表达载体pQE30,以构建人的Myostatin基因原核表达载体.构建的重组质粒pQE-Ms转染大肠杆菌宿主菌DH5α后,IPTG诱导表达重组蛋白.应用SDS-PAGE电泳和Western Blot分析和鉴定了重组蛋白的特异性,并用镍离子亲和色谱柱层析进行目的蛋白的纯化与鉴定.结果表明:重组质粒pQE-Ms酶切和测序结果与预期相符,SDS-PAGE电泳和Western Blot证实表达蛋白为目的蛋白,蛋白表达形式为包涵体,经镍离子螯合亲和层析柱纯化及鉴定,确定实验获得了高纯度的目的蛋白,为人体血清中Myostatin蛋白表达的检测及特异性抗体制备等研究提供了实验依据.     

毛冠鹿AIF-1原核载体的构建及表达

从毛冠鹿睾丸cDNA文库中筛选出毛冠鹿AIF-1基因,对其进行生物信息学分析,设计引物克隆毛冠鹿AIF-1 cDNA,连入pMD19-T载体,测序正确后酶切,与表达载体pET-28a(+)连接,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,并对可溶性蛋白进行纯化,SDSPAGE电泳,Western Blot分析以及鉴定重组蛋白.结果表明,毛冠鹿AIF-1(TdAIF-1)含有1个438bp的开放阅读框,编码145个氨基酸,经测序和酶切鉴定后,成功构建重组质粒pET-28a(+)-TdAIF-1,表达大小约20 kD的重组蛋白,主要以可溶形式存在,提高洗脱缓冲液中咪唑浓度至50 mmol/L、100 mmol/L能够得到较纯的蛋白.成功构建毛冠鹿AIF-1原核表达体系,获得重组蛋白,为研究AIF-1蛋白的生物学功能奠定了基础.     

毛冠鹿AIF-1原核载体的构建及表达

从毛冠鹿睾丸cDNA文库中筛选出毛冠鹿AIF-1基因,对其进行生物信息学分析,设计引物克隆毛冠鹿AIF-1 cDNA,连入pMD19-T载体,测序正确后酶切,与表达载体pET-28a(+)连接,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,并对可溶性蛋白进行纯化,SDSPAGE电泳,Western Blot分析以及鉴定重组蛋白.结果表明,毛冠鹿AIF-1(TdAIF-1)含有1个438bp的开放阅读框,编码145个氨基酸,经测序和酶切鉴定后,成功构建重组质粒pET-28a(+)-TdAIF-1,表达大小约20 kD的重组蛋白,主要以可溶形式存在,提高洗脱缓冲液中咪唑浓度至50 mmol/L、100 mmol/L能够得到较纯的蛋白.成功构建毛冠鹿AIF-1原核表达体系,获得重组蛋白,为研究AIF-1蛋白的生物学功能奠定了基础.     

羊布鲁菌外膜蛋白OMP2b的克隆，原核表达及纯化

研究羊布鲁菌外膜蛋白 OMP2b 基因的克隆,原核表达,以及纯化。根据羊布鲁菌 M5株外膜蛋白 OMP2b 蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为1130bp 的目的基因片断,克隆入融合表达载体 pGEX-4T-1,构建重组质粒 pGEX-4T-1-omp2b。在大肠埃希菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化。用 Western-blot 分析方法鉴定纯化蛋白。结果成功构建了 pGEX-4T-1-omp2b 原核表达载体并在大肠埃希菌中表达了 omp2b 基因,纯化后所获得的蛋白与目的蛋白大小一致且与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应,说明其为布鲁菌 OMP2b 蛋白。本研究成功构建了 pGEX-4T-1-omp2b 原核表达载体,并且在大肠埃希菌中进行表达,纯化的 OMP2b 蛋白具有良好的免疫原性。     

GST-NAP融合蛋白可溶性表达及柱上切割GST标签

利用基因工程的方法,以实验室保存的p MAL-C2X-NAP质粒为模板,PCR扩增NAP基因,构建重组质粒p GEX-NAP.重组质粒通过酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),再经IPTG低温诱导获得可溶性GST-NAP融合蛋白,最后利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶树脂进行纯化,Prescission蛋白酶进行柱上切割去除GST标签.结果表明,p GEX-NAP重组质粒构建正确,在大肠杆菌中经IPTG低温诱导表达,可获得大量可溶性GST-NAP融合蛋白.Prescission蛋白酶柱上切割去除GST标签后,经Western Blot验证NAP蛋白能被兔抗NAP多克隆抗体特异识别.     

水稻磷酸酯酶2A基因蛋白的原核表达载体构建、表达和纯化

利用PCR技术,从水稻品种日本晴幼穗cDNA中扩增磷酸酯酶2A的基因ORF片段,并将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中构建重组质粒pGEX-6p-1-PP-2A,经限制性内切酶酶切鉴定以及测序结果表明成功构建了原核表达载体pGEX-6p-1-PP2A。转化E.coli JM109并通过终浓度为0．4mmol／L的IPTG诱导,表达出39kD的CST-PP2A融合蛋白,并用蛋白亲和层析柱GSTrap FF对表达产物进行纯化,为下一步的研究打下了实验基础。     

人RACK1基因的克隆及原核表达

克隆人RACK1基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-RACK1,诱导表达重组蛋白,纯化后Western blot鉴定目的蛋白.根据GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)载体上的多克隆位点设计引物,以人胎肝cDNA文库为模板,钓取RACK1cDNA全长序列.将目的片段与原核表达载体pET-30a(+)连接,转入E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆.将测序正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达,利用镍柱对表达的蛋白进行纯化,Western blot法检测纯化的蛋白.结果显示,克隆得到的目的基因序列与GeneBank中已报道的序列完全一致,成功构建了pET-30a(+)-RACK1原核表达载体.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经镍离子亲和层析柱纯化后,Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应.本研究获得了人RACK1蛋白,为深入研究RACK1的功能奠定基础.     

羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d的原核表达、鉴定及纯化

研究羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d基因的克隆,原核表达,以及纯化,根据羊布鲁菌M5株外膜蛋白Omp25d蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为650bp的目的基因片断,克隆入融合表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-Omp25d。在大肠杆菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化。用Western-blot分析方法鉴定GST-Omp25d蛋白。结果成功地构建了pGEX-4T-1-Omp25d原核表达载体并在大肠杆菌中表达了Omp25d基因,纯化后所获得的融合蛋白与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应。表明研究成功构建了pGEX-4T-1-Omp25d元和表达载体,并且在大肠杆菌中进行表达,纯化的融合蛋白具有良好的免疫原性。     

羊布鲁菌外膜蛋白Omp22的原核表达及鉴定

布鲁菌外膜蛋白Omp22与布鲁菌致病性相关,又可诱导机体免疫反应。为进一步研究Omp22的特性,对其进行原核表达,并初步鉴定。根据Genbank序列,设计并合成羊布鲁菌外膜蛋白Omp22引物。以羊布鲁菌M5株基因组DAN为模板,PCR扩增并克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中。酶切鉴定正确后,测定序列;将重组质粒pGEX-4T-1-Omp22电转化大肠杆菌DH5α中,诱导表达,并采用羊布鲁菌兔免疫血清,Western-blot初步检测融合蛋白GST-Omp22表达情况和免疫学特性。结果PCR扩增出约660bp目的条带,与预期相符;酶切鉴定和测序结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-Omp22原核表达载体;优化诱导温度,结果表明,在25℃诱导表达时,该融合蛋白大部分出现在上清中;Western-blot结果证实,GST-Omp22可与羊布鲁菌兔免疫血清特异性结合。说明成功构建了Omp22蛋白原核表达载体并进行了可溶性表达;该融合蛋白可与羊布鲁菌兔免疫血清特异性结合。Omp22蛋白的表达,为进一步研究布鲁菌的致病机制以及疫苗研制奠定基础。     

细粒棘球绦虫重组pET30a-EgA31疫苗的构建和诱导表达

克隆细粒棘球绦虫EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析.从细粒棘球绦虫成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板RT-PCR 克隆获得EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E coli DH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆.IPTG初步诱导和表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平.测序表明选取的pET30a-EgA31阳性克隆均为正确连接EgA31抗原基因的重组质粒.经IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约为31 kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%.成功克隆并构建了pET30a-EgA31原核表达质粒.初步诱导表达出EgA31重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础.     

BIG-3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

原核表达、纯化骨形态发生蛋白诱导基因（BIG-3,BMP-2-induced gene 3kb）所编码的融合蛋白并制备其多克隆抗体。将BIG-3基因插入原核表达载体PGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况及Sepharose4B层析柱亲和层析法纯化的融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体,并以Western blot鉴定其特异性。结果在大肠杆菌中获得BIG-3-GST融合蛋白高水平的诱导表达,经Sepharose4B层析柱亲和层析,GST-BIG-3融合蛋白在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性。说明在大肠杆菌中成功表达且以亲和层析法纯化得到了BIG-3-GST融合蛋白,并制备了特异性较高的多克隆抗体。     

青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(TSHR)蛋白的融合表达及鉴定

为表达青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(the thyrotropin receptor,TSHR),构建了TSHR基因的原核表达载体pGEX-4T-1-TSHR,并将其转化入大肠杆菌DH5α中.采用IPTG诱导蛋白表达,并用SDS-PAGE分析表达蛋白.利用抗TSHR多克隆抗体进行Western blot检测.结果表明重组质粒在大肠杆菌DH5α中表达,融合蛋白的分子大小约为76kDa,Western blot检测说明得到的融合蛋白为TSHR蛋白,成功构建了文昌鱼TSHR基因的原核表达载体.     

人TCTP基因的克隆与原核表达

人翻译控制肿瘤蛋白（hTCTP）是一个在进化过程中高度保守且具有很高表达量的蛋白家族。本实验通过PCR技术扩增人hTCTP基因,经酶切后插入表达质粒pGEX-4T-2构建表达载体,转化大肠杆菌后挑选阳性菌进行菌落PCR及质粒酶切鉴定,确证克隆成功并构建了人hTCTP基因表达载体。重组表达载体经IPTG诱导表达出目的蛋白,用超声破碎、亲和层析和SDS-PAGE对目的蛋白进行了分离纯化并鉴定。     

水稻OsAAA1蛋白的原核表达载体构建及其可溶性表达研究

为使用外源表达载体表达并纯化有活性的水稻ATP酶蛋白Os AAA1,构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并进行体外IPTG诱导表达和Ni+柱亲和层析纯化.利用SDS-PAGE和Western Blot检测了目的蛋白.结果表明:将成功构建的p ET-32a-Os AAA1原核表达载体,转化到大肠杆菌Origami菌株后,在70~100 KD之间检测到可溶性目的蛋白带,并优化了诱导表达的较适温度、IPTG诱导浓度和诱导表达时间.故成功构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并获得了可溶性Os AAA1目的蛋白,为其后续研究奠定了基础.     

猪表皮生长因子在大肠杆菌中的串联表达

根据Gen Bank中猪表皮生长因子(p EGF)基因信息设计引物,通过PCR、亚克隆、基因重组等技术,构建得到p EGF拷贝数分别为1、2、3的原核重组表达质粒.用重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,在37℃诱导条件下,1、2、3拷贝p EGF重组质粒均能表达p EGF蛋白,灰度值分析表明:表达的融合蛋白占菌体蛋白总量分别为9.54%、20.37%、26.79%,表明在原核表达中,对p EGF进行同向串联,增加其拷贝数,可以提高p EGF在表达后融合蛋白中所占比例,相应提高p EGF蛋白产量.本研究为p EGF重组蛋白的高效表达和批量生产提供可靠的依据.