紫杉醇产生菌的筛选与发酵条件的调控

采用稀释倒平板法分别从云南红豆杉和南方红豆杉中分离出230余株内生真菌,经薄层层析、紫外及HPLC分析初步筛选,确定有5株表现出产紫杉醇的特性,其中1株真菌产率较高,约为1 mg/L.产紫杉醇的内生真菌菌丝体生长和紫杉醇积累之间存在相反的关系.低浓度乙酸铵(＜0.01 mmol/L)有利于菌丝体生长,不利于紫杉醇积累;较高浓度的乙酸铵不利于菌丝体生长而有利于紫杉醇积累.较高浓度的苯丙氨酸和酒石酸铵(＞0.05 mmol/L)有利于菌丝体生长,不利于紫杉醇积累;较低浓度的苯丙氨酸和酒石酸铵不利于菌丝体生长而有利于紫杉醇积累.亮氨酸对菌丝体生长和紫杉醇积累的影响很小;苯甲酸钠抑制菌丝体的生长和紫杉醇的积累.     

一株产紫杉醇的红豆杉内生真菌的分离鉴定

用组织研磨涂布法对中国红豆杉中产紫杉醇的内生真菌进行分离,得到45株内生真菌;通过形态学和分子生物学手段对一株产紫杉醇的菌株Tax-4进行鉴定,其结果为黑团壳属(Massaria)。表明从中国红豆杉中分离得到了一株产紫杉醇的黑团壳属内生真菌,丰富了产紫杉醇内生真菌的资源。     

南方红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离和筛选

从南方红豆杉中分离得到21株内生真菌,在PDA液体培养基中发酵后经HPLC检测,发现有3株能够产生紫杉醇,它们是XT5(Ectostromasp.)、XT2(botrytissp.)和XT17(Papulasporasp.),其紫杉醇产率分别是276.75μg/L、161.24μg/L和10.25μg/L.     

前体物和诱导子对内生真菌CH1产乙基长春胺的影响

为了提高内生真菌CH1 Geomyces sp.次级代谢产物乙基长春胺的产量,首先采用单因素试验法考查环氧合酶抑制剂萘普生、羟化酶诱导子过氧化氢、前体物色氨酸、色胺、马钱子苷及裂环马钱子苷对内生真菌CH1产乙基长春胺的影响;在单因素试验的基础上,采用SPSS(统计产品与服务解决方案)19.0设计L_(18)(3~6)正交试验,进一步优化各前体物和诱导子的质量浓度,并在最优条件下进行试验验证。研究结果表明:在内生真菌CH1发酵液中添加前体物和诱导子均对内生真产乙基长春胺有显著影响(显著性概率P小于0.05);当萘普生、色氨酸、色胺、马钱子苷和裂环马钱子苷质量浓度分别为8,100,95,105和25 mg/L,过氧化氢质量浓度为20μg/L时,能有效提高乙基长春胺的产量,在此条件下进行验证试验,乙基长春胺产量可达5.09mg/L,与不加前体物质相比提高2.63倍。     

红豆杉细胞聚集体悬浮培养生产紫杉醇

建立了中国红豆杉(Taxuschinensis)细胞聚集体两步法悬浮培养生产紫杉醇的培养体系.红豆杉细胞于含LH1g/L,NAA0.1mg/L,2,4-D0.5mg/L及6-BA0.8mg/L的细胞聚集体形成的培养基中生长并形成聚集体,10d后转入生产培养,较大细胞聚集体的生物量比和紫杉醇产量分别较对照组提高了53.7%和82.1%;提高细胞聚集体的生物量比能显著增加紫杉醇产量.四种基本培养基中B5最适合诱导细胞聚集体的形成.生长培养12d后细胞悬浮培养物按1∶1(体积比)直接转入生产培养对细胞生长、细胞聚集体和紫杉醇形成最有利.在100μmol/L茉莉酸甲酯作为诱导子下本体系紫杉醇产量较对照组提高了一倍.     

诱导子对拟茎点霉139产去乙酰真菌环氧乙酯的调节作用

去乙酰真菌环氧乙酯(DAM)是红树植物秋茄内生真菌拟茎点霉A123菌株产生的次级代谢产物,为了进一步提高DAM的产量,选择和制备了13种诱导子,对具有较强抗肿瘤活性的139菌株进行诱导,考察诱导子对菌株产DAM的调节作用.结果表明,白色假丝酵母菌(Candida albicans)细胞壁制备物和壳聚糖具有显著的正调节作用;采用CCD设计响应面实验获得最佳诱导条件为:发酵144 h后加入100 mg/L壳聚糖,通过高效液色谱仪测定DAM最高产量,其峰面积可达2 296.38,比同批空白对照提高36%.     

α-蒎烯促进海洋真菌Aspergillus sp.产真菌毒素青霉酸的研究

采自南海软珊瑚Sarcophyton tortuosum的内生真菌Aspergillus sp.在由葡萄糖10g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏2 g/L,100%海水,pH为7.5的培养基(GPY)中能够产生真菌毒素青霉酸,产量为5.5 mg/L.在GPY培养基中添加200 mg/L的单萜α-蒎烯,能改变代谢产物的组成和含量,并显著促进该真菌产生青霉酸,产量可提高至29.15 mg/L.结果表明α-蒎烯在该菌的作用下主要得到系列氧化产物,并进一步发生氧化降解.单萜α-蒎烯可以作为一个有效的诱导子,引起微生物的氧化应激反应,改变膜上酶系的活性,使代谢活动得到调控,改变代谢产物组成或产量,在微生物发酵工业上有潜在应用.     

几种胁迫因素对中国红豆杉细胞培养的影响

中国红豆杉细胞培养过程中,在第10d添加0．6mg/mL的真菌F5提取物可使紫杉醇的合成量达300μg/g干重细胞;在培养第20d添加20mg/LAg^ ,紫杉醇的合成量达83μg/g干重细胞;在培养第20d添加4mg/Cu^2 ,紫杉醇的合成量达35μg/g干重细胞。     

两种红豆杉离体细胞中紫杉醇含量的调节

以矮壮素、水杨酸和甘露醇为诱发子,研究了短叶红豆杉(Taxus brevifolia)和墨西哥红豆杉(Taxus globosa)离体细胞中紫杉醇含量的变化.实验结果表明:矮壮素、水杨酸和甘露醇不同程度地提高离体细胞中紫杉醇含量.短叶红豆杉的紫杉醇含量比墨西哥红豆杉的高,但诱发子诱导墨西哥红豆杉紫杉醇相对增加量大.0.5 mg*L-1水杨酸和0.5 mg·L-1矮壮素分别使短叶红豆杉和墨西哥红豆杉细胞中紫杉醇含量达到最高,分别是对照的1.8和15倍.还讨论了紫杉醇含量与愈伤组织生长的关系.     

几种胁迫因素对中国红豆杉细胞培养的影响

中国红豆杉细胞培养过程中 ,在第 10d添加 0 .6mg/mL的真菌F5提取物可使紫杉醇的合成量达 30 0μg/ g干重细胞 ;在培养第 2 0d添加 2 0mg/LAg+ ,紫杉醇的合成量达 83μg/ g干重细胞 ;在培养第 2 0d添加 4mg/LCu2 + ,紫杉醇的合成量达 35 μg/ g干重细胞     

两种红豆杉植物的愈伤组织培养及褐化抑制

在DPS系统均匀设计的基础上,对曼地亚红豆杉(Taxus m edia)和南方红豆杉(Taxus chinensisvar.mairei)的茎和叶进行愈伤组织培养,并探讨愈伤组织褐化的抑制.结果表明:两种植物茎形成愈伤组织能力均强于叶;同一种红豆杉植物愈伤组织诱导率与其直径存在一元线性回归关系;B5培养基添加0.3 mg/L 6-BA和2.9mg/L NAA(曼地亚红豆杉)、0.1 mg/L 6-BA和1.7 mg/L NAA(南方红豆杉)为最适合愈伤组织诱导和生长的培养基;南方红豆杉茎和叶产生愈伤组织平均时间分别少于曼地亚红豆杉茎和叶,其茎和叶愈伤组织平均直径显著大于曼地亚红豆杉;培养基添加0.01~0.2 mg/L抗坏血酸(Vc)能较为有效抑制愈伤组织褐化.     

稀土和氮源对南方红豆杉细胞生长及紫杉醇积累的影响

研究稀土和氮源在 B5培养基上对南方红豆杉细胞悬浮培养时的影响 .结果表明 :在所研究的 3种稀土元素中 ,1× 1 0 - 5mmol/L的 Yb Cl3,最利于细胞生长和紫杉醇的积累 ,紫杉醇含量达1 .3 46mg/L.氮源总浓度 (包括 NH4 +和 NO3- )为 2 7mmol/L,NH4 +和 NO3-比例为 2 /2 5 ,有利于南方红豆杉细胞生长和紫杉醇的合成 .     

几种释放因素对紫杉醇合成与释放的影响

比较研究了几种释放因素对红豆杉细胞生长和紫杉醇合成与释放的影响,结果表明,在中国红豆杉细胞悬浮培养过程中,在细胞生长对数期（14d)加入φ＝5％二甲亚砜及0．2mol/L甘露醇,能显著提高紫杉醇的合成及释放,紫杉醇总产量达到16mg/L,在细胞生长在对数期（14d)加入0．04mol/L氯化钠时,紫杉醇总产量达到7．3mg/L,在细胞生长对数期（14d）加入2mg/L硫酸铈铵时,紫杉醇总产量达到24mg/L。     

红豆杉内生真菌Fusarium solani B2-1萘酮类代谢产物研究

从红豆杉中分离得到一株内生真菌Fusarium solani B2-1,经大米固体发酵以后,从乙酸乙酯提取物中分离得到4个萘酮类次级代谢产物1～4,鉴定为Dihydronaphthalenone(1)、5-Hydroxydihydrofusarubin C(2)、镰红菌素(3)和Chrysanthones B(4).其中,化合物4为首次从镰刀霉属(Fusarium)真菌中分离得到.化合物1～4具有微弱的抑制海分枝杆菌Mycobacterium marinum ATCCBAA-535增殖活性,浓度为10 μg/mL下的抑制率分别为27.6%、25.0%、28.4%和24.4%.     

α-蒎烯促进海洋真菌Aspergillus sp.产真菌毒素青霉酸的研究

 采自南海软珊瑚Sarcophyton tortuosum的内生真菌Aspergillus sp.在由葡萄糖10 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏2 g/L,100％海水,pH为7.5的培养基（GPY）中能够产生真菌毒素青霉酸,产量为5.5 mg/L。在GPY培养基中添加200 mg/L的单萜α 蒎烯,能改变代谢产物的组成和含量,并显著促进该真菌产生青霉酸,产量可提高至29.15 mg/L。结果表明α 蒎烯在该菌的作用下主要得到系列氧化产物,并进一步发生氧化降解。单萜α 蒎烯可以作为一个有效的诱导子,引起微生物的氧化应激反应,改变膜上酶系的活性,使代谢活动得到调控,改变代谢产物组成或产量,在微生物发酵工业上有潜在应用。     

固态培养对产紫杉醇真菌小孢拟盘多毛孢次级代谢物生成影响

激活真菌基因组中沉默基因簇,可令其产生新的次生代谢产物,改变培养条件是有效的激活方法.本文研究了固态培养方法对一株产抗癌药物紫杉醇(Taxol)真菌——小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)次级代谢产物生成的影响.实验发现固体发酵能够产生2种液体发酵中没有的产物,对其中一种产物进行了高效液相色谱(HPLC)分离纯化和定量分析.该物质的最高产量达到每克培养基质0.354mg,在HPLC谱上的保留时间和紫杉醇接近,值得进一步研究其结构和生物学活性.近年来,固体发酵技术以其独特性和环保优势,再次受到重视.本实验显示固态培养能够诱导该真菌产生2种稳定的次生代谢物,比单纯液体发酵更有优势.本研究还优化了固体发酵基质、发酵时间等条件,为进一步后续研究提供参考.     

一株产紫杉醇的内生真菌的分离及产物鉴定

从云南红豆杉树皮中分离得到内生真菌Ｍ１１,经液体、固体发酵,用薄层层析法对该真菌的培养物、菌丝体提取物进行了分析,结果表明菌株Ｍ１１能合成抗癌药物紫杉醇     

青钱柳产黄酮类物质真菌的分离与鉴定

【目的】对青钱柳产黄酮内生真菌进行鉴定,探究提取黄酮类物质的新方法。【方法】采用组织分离对青钱柳枝、叶、根、皮的内生真菌进行分离,用不同培养基进行培养,观察其形态特征进行初步分类;通过显色反应、薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)对内生真菌的发酵产物进行分析,筛选产黄酮类物质的内生真菌,并测定总黄酮产量。根据菌株的形态学特征,结合真菌rDNA的居间序列(internal transcribed spacer, ITS)的系统进化分析鉴定。【结果】分离得到67株内生真菌,通过菌落形态和显微形态观察,隶属于3纲、4目、6科、10属;最终确定4株产黄酮物质的内生真菌:PZ06、CY12、CP06、PP03,其中黄酮产量最多的是菌株PZ06,产量为3.61 mg/L。分子鉴定结合4种菌株的形态学鉴定结果表明,PZ06、CP06、PP03均属于链格孢属(Alternaria),CY12属于正青霉属(Eupenicillium)。【结论】青钱柳产黄酮的优势菌群为链格孢属(Alternaria)。该研究对植物内生菌的开发利用有着重要参考意义,产黄酮类物质的内生真菌的发现为活性物质的提取提供了新方法。     

从植物分离产紫杉醇的内生真菌的研究

将生于秦岭地区的中国红豆杉树皮中分离得到的一株内生真菌,在马铃薯培养基中进行发酵试验,用薄层层析、薄层扫描检测。分析结果表明这株真菌能合成紫杉醇,高效液相色谱技术测定其紫杉醇含量约为１４．２０μｇ／Ｌ。     

Cu~(2+)、前体对红豆杉细胞生长及产生10-Deacetyl Baccatin的影响

目的:研究前体和Cu2+诱导子对云南红豆杉细胞生长和产生10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的影响.方法:在培养12d后分别向培养基中添加不同浓度的乙酸钠、苯甲酸钠两种前体和CuSO4诱导子,经过培养对云南红豆杉细胞生长情况进行统计,用HPLC测定细胞中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量.结果:培养基中添加0.1mmol/L乙酸钠和0.1nunol/L苯钾酸钠,10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量是不添加时的1.8倍和2.8倍,含量分别为0.079 88%、0.08291%;B5培养基中添加0.1mg/L硫酸铜时,10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量是B5培养基标准含量的2.2倍.结论:确定了云南红豆杉细胞悬浮培养过程中B5培养基添加乙酸钠、苯甲酸钠和硫酸铜的最佳浓度,表明适宜浓度前体和Cu2+诱导子对10-去乙酰巴卡亭Ⅲ合成与释放有显著影响.