鱼类神经坏死病毒研究进展

神经坏死病毒(nervous necrosis virus, NNV)是病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis, VNN)的病原，可感染120余种海水鱼，感染后导致鱼类脑部与视网膜空泡化，发病死亡率最高可达100%.综述了神经坏死病毒的基因组、编码的蛋白、病毒的受体、诱导的免疫反应以及病毒的检测与防治研究，并对该疾病未来的防治手段和研究方向进行了探讨，以期对科学防治神经坏死病提供理论依据，推进石斑鱼、海鲈鱼等海水鱼养殖业的发展.     

基于新型核酸适配体-荧光分子检测探针的石斑鱼虹彩病毒病快速诊断

【目的】石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是引起华南沿海地区重要海水养殖鱼类石斑鱼(Epinephelus tauvina)发生病毒性鱼病的主要病毒性病原之一,其引起的鱼病具有发病迅速、死亡率高、流行面广等特点,严重威胁华南地区石斑鱼养殖业的健康可持续发展。着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的SGIV快速检测技术,对于及早发现、确定病原,进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失至关重要。【方法】基于核酸适配体(Q2)就SGIV病的快速检测诊断技术进行系统研究,开发出一种新型的核酸适配体-荧光分子检测探针(Aptamer Q2-based fluorescent molecular probe,Q2-AFMP),并对Q2-AFMP检测SGIV感染的特异性、灵敏性和稳定性进行分析。【结果】Q2-AFMP可以特异性检测SGIV感染,且其灵敏性和稳定性均比较高。【结论】本研究中基于核酸适配体构建的新型高特异性荧光分子探针(Q2-AFMP)有望实现对海水养殖中石斑鱼虹彩病毒病的快速诊断、实时监控和有效预防。     

鸡六种病毒多重PCR检测方法的建立和应用

禽流感(Avian influenza,AI)、鸡新城疫(Newcastle disease,ND)、鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)、鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)、鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)和鸡减蛋综合症(Egg drop syndrome 76,EDS-76)是6种常见的禽类病毒性传染病,给养鸡业造成重大经济损失。依据NCBI核酸数据库中禽流感病毒(Aiv)、新城疫病毒(Ndv)、鸡传染性支气管炎病毒(Ibv)、传染性法氏囊病(Ibdv)、鸡传染性喉气管炎病毒(Iltv)及减蛋综合征病毒(Edsv)基因序列,设计了6对特异性引物,建立并优化针对鸡Aiv、Ndv、Ibv、Ibdv、Iltv和Edsv的多重PCR鉴别诊断方法,同时进行现场检测应用。结果显示该多重PCR体系检测限为100fg,与其他常见病原体无交叉反应。研究表明鸡六种病毒多重PCR方法具有较高敏感性与特异性,在禽类常见病毒现场诊断方面具有广阔的应用前景。     

斜带石斑鱼神经坏死病毒基因组RNA1和RNA2序列测定及分析

根据GenBank数据库公布的鱼类神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)同源序列设计了7对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增出目的片断,将PCR产物测序和分析.斜带石斑鱼Epinephelus coioides神经坏死病毒(orange-spotted NNV,OGNNV)基因组由两个片断(RNA1和RNA2)组成,RNA1由3 103个核苷酸组成,含有一个开放阅读框,编码982个氨基酸;RNA2由1 433个核苷酸组成,含有一个开放阅读框,编码338个氨基酸.OGNNV基因组与新加坡GGNNV(greasy grouper NNV)的基因组有高度的相似性.分析病毒的RNA2序列发现:OGNNV与DGNNV(dragon grouper NNV)、RGNNV(redspotted NNV)和GGNNV的亲缘关系很近,并且具有相同的中和位点;分析病毒的RNA1序列,发现在OGNNV的RNA1序列中同样可以找到依赖RNA的RNA聚合酶的6个模序(motif).根据同源性比较和系统进化分析,OGNNV属于RGNNV血清型的成员.     

斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白的原核表达与纯化

将含有斜带石斑鱼Epinephelus coioides神经坏死病毒(orange-spotted grouper nervous necrosis virus,OGNNV)主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因的重组表达质粒载体pET32a-MCP转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合表达,经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,证实了重组大肠杆菌融合表达了斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白.表达的融合蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在,提取的包涵体中融合蛋白含量占60%以上,经柱层析纯化蛋白,纯化度达90%以上.     

雏鹅新型病毒性肠炎病原快速检测技术的建立及应用

根据小鹅瘟病毒(GPV)和鹅源禽腺病毒(FAV)基因组序列特征分别设计了各自的PCR引物,经对反应条件的优化建立了能同时检测两种病毒的二重PCR方法．该法能从雏鹅新型病毒性肠炎和小鹅瘟疫苗株以及分离的鹅源腺病毒蚀斑克隆株分别扩增出相应的特异性产物,而对其它常见鹅病的病原及正常鹅胚肝组织的扩增结果均为阴性;对来自广西不同地方的36份临床病例样品的检测发现,其中具有雏鹅新型病毒性肠炎典型病变的22份样品均可检出GPV和FAV两种病毒．其它的有4份只检出GPV,3份只检出FAV;12份健康雏鹅肝组织中仅有一份检测到GPV;健康成鹅泄殖腔中GPV和FAV的检出率分别达44．29％、37．14％二者都有的占1．43％．结果表明,雏鹅新型病毒性肠炎的病原可能包括GPV和FAV两种病毒;建立的PCR诊断技术具有快速、敏感、特异的特点,可用于该病征的临床快速鉴别诊断以及流行病学的调查研究．     

闽南地区紫石斑(Epinephelus lanceolatus)幼鱼爆发性传染病的病原学研究

应用RT-PCR技术．检测了福建南部石斑鱼育苗场患病紫石斑鱼的病原．结果检出神经坏死病毒；对该病毒的RT-PCR产物进行了核酸测序和序列分析．与基因库中马拉巴斑和紫石斑神经坏死病毒编码病毒核衣壳蛋白的基因片段序列的同源性大于97％．病原菌分离鉴定结果．有2菌株分别是溶藻弧菌和豚鼠气单胞菌．对实验动物有一定的毒力．药敏试验表明这些菌株对常用抗生素表现耐药．临床症状和实验结果都表明．神经坏死病毒感染是导致石斑鱼大批死亡的主要原因．而溶藻弧菌和豚鼠气单胞菌应为继发感染．加重了病情．使更多的石斑鱼死亡．     

大熊猫粪便样品中犬瘟热病毒的检测

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒(CDV)N基因序列,设计合成1对特异性引物,以犬瘟热病毒疫苗中提取的RNA为阳性模板建立了快速检测CDV的RT-PCR方法,结果显示,所建立的CDV RT-PCR扩增得到与理论设计值大小一致的456 bp的特异性片段,对犬细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、大肠杆菌(E.coli)和新城疫病毒(NDV)的扩增结果均为阴性;最低可检出约1.53×10~2拷贝/μL的核酸;重复性试验结果表明,该方法检测重复性好.此方法对成都大熊猫繁育研究基地的37份眼观正常的大熊猫粪便样品检测,未检测出犬瘟热病毒,与胶体金试纸卡检测结果一致.     

单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ半巢式PCR检测方法的建立和在病毒性脑炎诊断中的应用

为进一步提高 PCR诊断方法的特异性和敏感性 ,在单纯疱疹病毒 ( HSV) TK基因区设计了一对外层公用引物和两个内层分型引物 ,建立了半巢式 PCR检测和分型 HSV的方法。用该方法检测了天津地区 64例病毒性脑炎患者 (病脑组 )和 4 6例其他中枢神经系统疾病患者 (对照组 )的脑脊液 ( CSF)标本。病脑组了阳性率为 1 5.63% ( 1 0 / 64) ,其中 9例为 HSV-1感染 ,1例为 HSV-2感染。对照组阳性率为 2 .1 7% ( 1 / 46)。本方法在发病后第 1天即可测出 CSF中的 HSV DNA,敏感性为 0 .0 1 TCID50 。     

实验动物雪貂阿留申病病毒核酸检测方法的建立

目的 建立阿留申病病毒PCR检测方法,以用于实验动物雪貂阿留申病病毒的检测。方法 参考Genebank中阿留申病病毒核酸VP2基因序列设计一对引物,建立PCR检测方法,进行特异性、敏感性测试,并对实验雪貂粪便样品进行筛查。结果 测序结果显示,使用设计的引物可特异性地扩增获得阿留申病病毒的VP2中531 bp基因片段;在常见实验动物DNA病毒,小鼠多瘤病毒、小鼠细小病毒、犬细小病毒、疱疹病毒、鼠痘病毒、仙台病毒、小鼠腺病毒中均未扩增出目的条带;以目的片段核酸为模板测试该方法敏感性,检测下限达到90. 6 copy/μL。应用该方法对39份雪貂粪便样品进行检测,未检测出阿留申病病毒核酸阳性。结论 本研究建立的方法具备一定的特异性和敏感性,可作为实验动物雪貂中阿留申病病毒感染病原筛查的方法。     

多种细菌与凡纳滨对虾肝胰腺坏死症(HPNS)爆发有关

近年来,在中国南方超过50%以上的凡纳滨对虾养殖场在养殖30 d后爆发1种疾病,导致80%以上的养殖对虾死亡。患病对虾临床症状为肝胰腺萎缩坏死、活动力减弱、对虾在池塘底部死亡,发病初期水面和池塘边观察不到病虾,因此养殖者通常将该病称为"偷死病"。患病对虾肝胰腺萎缩坏死是主要症状,因此,我们称这种对虾疾病为对虾肝胰腺坏死症(hepatopancreas necrosis syndrome,HPNS)。2012年3月-2013年10月,我们在中国南方广东、海南和广西3个省的12个养殖地区采集具有HPNS症状的凡纳滨对虾进行了组织病理观察、病毒检测与人工感染、细菌分离鉴定与人工感染研究。组织病理学研究表明具有HPNS症状的病虾肝胰腺坏死,在部分区域肝胰腺管细胞消失,肝胰腺小管间结缔组织减少。对305尾HPNS对虾进行11种对虾病毒PCR检测,并采用人工病毒感染方式感染健康对虾,感染对虾不表现HPNS症状。从63尾HPNS病虾的肝胰腺、血淋巴和肠道分离鉴定383株细菌,这些细菌分别属于10个属,49种细菌,每尾对虾均混合感染多种细菌,其中38尾对虾中分离到副溶血弧菌,34尾对虾中分离到蜡样芽孢杆菌,20尾对虾中分离到苏云金芽孢杆菌,19尾对虾中分离到霍乱弧菌。选取副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌分别采用注射和浸泡方式感染健康对虾,感染对虾均出现HPNS症状。结果表明多种细菌与凡纳滨对虾HPNS爆发有关。     

大黄鱼人工感染杀香鱼假单胞菌的病理形态学及病原分布的初步研究

为了研究杀香鱼假单胞菌在感染大黄鱼体内的分布状况及其所致各器官的病理损伤特点,通过人工回感试验,利用组织切片及免疫组化技术对感染大黄鱼的肝脏、脾脏、肾脏及鳃组织进行了组织病理切片,并进行HE染色和免疫组化分析。结果显示,人工感染发病大黄鱼临床症状与自然感染发病症状一致,病鱼体表无明显病症,但肝、脾、肾等内脏有大量白色结节;组织病理显示,病鱼肝脏、脾脏和肾脏是感染损伤的主要靶器官,内脏组织发生变性、坏死以及出现特征性的病理性结节;免疫组化检测特异性阳性信号出现在病鱼内脏组织器官的血窦或血管以及巨噬细胞内。研究表明,杀香鱼假单胞菌侵入鱼体后,主要分布在机体的血液中并大量增殖,通过血液循环到达鱼体各内脏器官;杀香鱼假单胞菌在鱼组织内的分布与其所致病理损伤之间呈正相关。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征的RT-PCR诊断

根据猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的全基因组序列,设计合成一对特异性引物,建立检测PRRSV的RT-PCR方法。对两份疑似病料进行检测,结果两份均为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒阳性。结合流行病学,临床症状以及病理解剖变化,诊断为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒感染。     

应用PCR技术对家禽病毒性肿瘤病进行鉴别诊断的研究进展

概述聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术应用于家禽马立克氏病、禽白血病和网状内皮增生症鉴别诊断的研究进展,主要内容包括病毒的基因组结构特征,各病毒的特异性基因或序列及其ＰＣＲ引物的位置和序列,以及ＰＣＲ技术对肿瘤病特异鉴别诊断的应用。将ＰＣＲ技术与其它传统的技术进行比较,ＰＣＲ技术具有敏感性高、特异性好、快速、简便的特点,是目前鉴别诊断家禽病毒性肿瘤病最有效的、最快捷的方法之一。     

基于核酸适配体Q5的石斑鱼虹彩病毒快速检测技术

石斑鱼虹彩病毒(Grouper iridovirus,SGIV)在不同鱼群之间迅速传播,其致死率极高,严重制约了我国海水石斑鱼(Epinephelus tauvina)养殖业健康可持续发展。为了及早发现和鉴定出病原,降低经济损失,促进渔业发展,开发方便快捷的石斑鱼虹彩病毒检测技术已迫在眉睫。本研究基于核酸适配体Q5,研发出一种核酸适配体Q5-荧光分子探针(Aptamer Q5-based fluorescent molecular probe,Q5-AFMP),并且对Q5-AFMP检测感染石斑鱼虹彩病毒的特异性,以及Q5-AFMP在细胞水平和组织水平检测石斑鱼虹彩病毒感染的灵敏度进行分析。研究结果表明:Q5-AFMP能够在细胞水平和组织水平高特异性检测出石斑鱼虹彩病毒的感染,而且具有较高的灵敏度。因此Q5-AFMP能够用于石斑鱼虹彩病毒的快速检测和诊断。     

吐鲁番温室番茄病株及传毒烟粉虱的双生病毒检测与鉴定

为了明确吐鲁番地区温室番茄黄化曲叶病的病毒种类及传毒烟粉虱的生物型及携带病毒的情况,本研究利用番茄黄化曲叶病毒的特异引物通过PCR检测和DNA测序,对温室采集的43个番茄病株进行了病毒种类的分子鉴定;利用烟粉虱特异引物和番茄黄化曲叶病毒特异性引物通过PCR检测和DNA测序,对鄯善县温室采集的180头烟粉虱进行了生物型鉴定和带毒检测,并构建了双重PCR检测方法。结果显示:吐鲁番市和鄯善县温室发生的番茄黄化曲叶病的病毒种类为番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV),病株带毒率为39.5%。鄯善县温室发生的烟粉虱主要为Q型烟粉虱,带毒率为67.8%,是主要的传毒介体。本研究建立的双重PCR检测技术,能快速有效地确定Q型烟粉虱的生物型和携带TYLCV的情况。     

高致病性禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断高致病性禽流感,根据H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成两对特异性引物,利用这两对引物对H 5,H 7亚型禽流感病毒的HA基因片断进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这两对引物能特异性地扩增出H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490 bp和375 bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H 5,H 7亚型高致病性禽流感病毒的分子诊断方法。     

香蕉束顶病毒(BBTV)的快速提取检测方法

香蕉束顶病毒(Banana Bunchy Top Virus,BBTV)是香蕉上一种危害严重但又难以防治的病毒。目前只能通过及时铲除染病植株来控制传播,因此快速有效的病毒检测技术是防治BBTV的关键。BBTV为单链环状DNA病毒,本试验采用优化后的DNA提取方法提取感病的香蕉样品的DNA,并用特异性引物对提取产物进行PCR检测。结果显示本试验优化的方法操作方便、用时短,并且提取产物能够用于BBTV快速检测,从而为BBTV的快速检测提供新的方法。     

牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV/MDV)的分子生物学研究进展

牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus/mucosal disease virus,BVDV/MDV)是引起牛病毒性腹泻/粘膜病的病原,与猪瘟病毒(CSFV)、羊边界病病毒(BDV)同属.其基因组由5‘非翻译区(5‘UTR)、一个大的开放阅读框(ORF)和3‘非编码区(3‘NCR)组成,编码结构蛋白P14、gP48、gP25、gP53及几种非结构蛋白.下面就BVD/MD的分子生物学研究进展做一综述,以便给该病的进一步防制奠定理论基础.     

桑树萎缩病类菌原体的PCR检测

通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ），用多对引物探讨了桑树萎缩病类菌原体的分子检测．结果显示，所用引物中只有Ｒ１６Ｆ２／Ｒ２和Ｒ１６（Ⅰ）Ｆ１／Ｒ１适用于桑树萎缩病类菌原体的检测，呈现不同症状的黄化型、萎缩型和其它两种类型的病株都扩增出类菌原体１６ＳｒＤＮＡ的片段．根据组特异性引物对四种症状类型中类菌原体１６ＳｒＤＮＡ的扩增，对我国桑树萎缩病类菌原体的分组状况进行了讨论．