猪STAT4、STAT6基因克隆及组织表达研究

本研究以长白猪为材料,克隆了STAT4和STAT6基因的cDNA全长,其中STAT4基因cDNA全长2269 bp,编码748个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠等哺乳动物STAT4氨基酸序列一致性分别为97%、98%、96%、96%;STAT6基因cDNA全长2637 bp,编码847个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠等哺乳动物的氨基酸序列有很高的同源性,分别为93%、95%、88%和87%.采用RT-PCR方法,本研究对家猪STAT4和STAT6基因进行组织表达分析.结果显示:STAT4在所有组织中都有表达,STAT6在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、小肠等组织中有表达.此外,本研究已将家猪STAT4和STAT6基因编码区序列克隆到真核表达栽体pcDNA3.1(+)中,并做了初步功能鉴定.     

猪SOSC5和SOCS6基因克隆及组织表达研究

本文以长白猪(Landrace)大脑cDNA为模板,克隆得到长白猪细胞因子抑制因子SOCS-5基因和长白猪SOCS-6基因.序列分析结果显示:长白猪SOCS-5基因cDNA全长1688 bp,编码一个含有536个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列一致性分别为97％、97％、94％和95％;SOCS-6基因cDNA全长1645 bp,编码一个含有535个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列同源性分别为:92％,97％,85％,82％.氨基酸结构分析显示,长白猪SOCS-5和SOCS-6基因都具有典型的中央SH2结构域和C末端有40个氨基酸的SOCS Box结构域;组织表达图谱分析结果显示:长白猪SOCS5基因在大脑、心脏、脾脏、肌肉组织大量表达,在下丘脑、肝脏、肾脏、小肠中也有表达;SOCS6基因在大脑、下丘脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉及小肠均大量表达.此外,本研究还将SOCS-5和SOCS-6基因编码区序列克隆转入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,为下一步功能验证做准备.     

人Megalin基因四个结构域的cDNA克隆

以人肾脏组织cDNA为模板,用PCR技术克隆了编码人Megalin基因四个结构域的cDNA,并对其进行了测序.结果表明,编码人Megalin基因四个结构域的cDNA长度分别为863bp、1,008 bp、1,247 bp及1,359 bp.编码第一结构域的cDNA序列与GenBank报道的序列有99.9%的同源性,其中两个位点有差异(第457位和605位分别为C和G,而非G和A);其余三个结构域对应的基因序列与GenBank报道的序列完全相同.     

蒙古鮊ob基因的克隆与组织表达特异性的初步研究

根据已知的人和鼠ob基因序列设计引物,通过运用RT-PCR技术首次从蒙古鮊脂肪组织的RNA中扩增获得ob基因片段,并经序列分析证实为ob基因编码区438 bp的序列.不同物种同源性比较表明ob基因序列具有很高的保守性:蒙古鮊与人、猪和鼠的ob基因核苷酸编码序列的同源性分别为82.9%、84.0%和99.1%;蒙古鮊ob基因编码的蛋白leptin氨基酸序列与人、猪和鼠氨基酸同源性分别为80.8%、78.8%和95.9%.用RT-PCR技术分析组织ob基因的表达特异性,结果表明:ob基因在脂肪和肝脏组织中的表达量最大,在心脏、脾脏、肌肉、脑、卵巢中的表达量次之,在肾脏中仅微量表达,而在精巢和肠道组织中则不表达.     

鳜鱼(S.Keneri)肌球蛋白重链基因cDNA的克隆及其特征分析

鳜鱼(S.Keneri)以优良肉质性状成为极具商品价值和大力推广人工养殖名贵鱼类之一.为掌握控制优良肉质性状的遗传基础,采用同源克隆RT-PCR方法,克隆出该鱼肌球蛋白重链(MYH)cDNA序列.该基因cDNA序列全长5938bp,编码区长度为5814bp,含有poly(A)信号,3’非翻译区长124bp,其开放阅读框共编码1938个氨基酸,推算蛋白质分子质量为221.6Ku.鳜MYH基因由3个结构域组成,即MYSc-type-Ⅱ,SMC-N和Myosintail 1,其中MYSc-type-Ⅱ头部结构与鲤、斑马鱼同源性达90%,具高度保守性.通过DNAstar软件MegAlign构建进化树显示不同物种间该基因核苷酸编码序列同源性为77%—86%,氨基酸编码序列同源性达80%—92%.采用RT-PCR方法研究MYH在不同发育阶段差异表达结果表明,MYH在肌肉效应期开始有低量表达,成鱼期和鱼苗期表达量高,而囊胚期与神经胚均未表达.由此推测MYH基因于肌肉效应期开始表达.研究结果揭示鳜鱼肌球蛋白重链基因在进化上保持与其他脊椎动物相似性和差异性,为决定名贵鱼类肉质结构基因的研究提供了分子生物学基础.     

枸杞抗坏血酸氧化酶基因的克隆与表达分析

以枸杞为材料,利用同源克隆技术,克隆了枸杞抗坏血酸氧化酶(AO)的全长cDNA序列,命名为LcAO基因(GenBank:KP712033),该基因开放阅读框(ORF)大小为1737bp,编码578个氨基酸,与西红柿AO蛋白的同源性达到90%.LcAO编码的氨基酸序列包含3个多铜氧化酶结构域和跨膜信号序列.采用实时荧光定量PCR分析显示,LcAO基因在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少.     

猪Akt3基因克隆、序列分析及组织表达图谱研究

本研究以长白猪(Landrace)肌肉cDNA为模板,克隆得到长白猪Akt3基因.序列分析结果显示:长白猪Akt3基因cDNA全长1493bp,编码一个含479个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列一致性分别为100%、100%、99.58%、99.79%,具有高度保守性.氨基酸结构分析显示,长白猪Akt3基因都具有典型的Pleckstrin homologous domain(PH)结构域和丝氨酸/苏氨酸磷酸化激活位点.组织表达图谱分析结果显示:Akt3基因在所有检测的家猪组织中均有表达.此外,本研究还将Akt3基因编码区序列克隆转入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,为下一步功能验证做准备.     

眼斑拟石首鱼肽聚糖识别蛋白2的基因克隆与组织表达特性

采用同源克隆技术获得了眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)的肽聚糖识别蛋白2基因(命名为So-pglyrp2).So-pglyrp2的cDNA全长1 729 bp,含有1个1 446 bp的开放阅读框,编码的482 aa前体蛋白带有1个21 aa信号肽;So-pglyrp2基因由4个外显子和3个内含子构成.序列比对分析表明,So-pglyrp2存在1个保守的PGRP结构域,其氨基酸序列与已报道的脊椎动物pglyrp2的同源性最高,一致性为57.1%~82.8%.RT-PCR分析表明,So-pglyrp2基因在肝脏强烈表达,在性腺、肠和胃组织弱表达,在其他组织不表达.研究结果为阐明鱼类pglyrp2基因结构、了解低等脊椎动物pglyrp2的进化地位、探讨鱼类pglyrp2的免疫学功能奠定了坚实的基础.     

大熊猫核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的cDNA克隆及序列分析

RPL30是核糖体大亚基60S的组成部分,由RPL30基因所编码,主要存在于真核生物中.根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,以大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的肌肉组织为材料,成功地克隆了核糖体蛋白L30亚基RPL30基因,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫L30亚基基因的表达序列长为388bp,开放阅读框(ORF)为348 bp,编码115个氨基酸的蛋白质,并含有6个功能位点.进一步分析发现,该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的人、牛、褐家鼠、小家鼠有很高的相似性,其表达序列同源性分别为93.97%,96.26%,89.66%和89.94%,其编码的氨基酸序列同源性分别为99.13%,98.26%,99.13%,99.13%,且其蛋白质的高级结构相似性也很高.     

猪PSMD13基因的克隆与表达谱分析

为了研究猪PSMD13基因功能,采用SMART-RACE技术对猪PSMD13基因5′和3′端进行扩增,并对其进行序列分析和组织表达分析。结果表明,得到猪PSMD13基因全长1476bp的cDNA序列,其基因编码376个氨基酸,与人、小鼠、蛙、鲐鱼的PSMD13氨基酸序列分别有97%、94%、77%、85%的同源性,含有1个PINT保守结构域和1个类似的PCI domain结构域,无信号肽序列。组织表达分析结果表明,猪PSMD13在背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、子宫、睾丸、胚胎和脂肪等组织均有表达。     

小鼠胚胎脑特异表达的新基因bsg3的克隆及初步研究

通过消减差异筛选的方法克隆到一个在小鼠胚胎脑特异表达的基因bsg3(brain specific gene 3).它编码的蛋白与人的KIAA0961具有80.3%的同源性.bsg3基因包含一个1644bp的完整阅读框,编码一个含548个氨基酸,具有1个KRAB结构域(kruppel-associated box)和13个C2H2型锌指结构域的蛋白.该基因定位在小鼠第7号染色体上,包含5个外显子,4个内含子.以bsg3基因全长编码区为探针的原位杂交结果显示,bsg3在小鼠胚胎脑及鸡胚脑特异表达.半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的结果表明,在成体小鼠的组织中,bsg3基因脑中表达也较强.这提示bsg3基因可能在小鼠脑发育中起着重要的作用.对bsg3基因时间和空间的表达模式的分析将有助于进一步揭示它在脑发育及功能维持中的作用.     

草鱼原肌球蛋白基因的克隆及其组织表达

为揭示原肌球蛋白基因在草鱼肌肉中的作用,利用RT-PCR和RACE技术克隆获得了草鱼原肌球蛋白基因c DNA,并对该基因在普通草鱼和脆肉鲩不同组织中的表达情况进行研究分析。结果表明原肌球蛋白基因c DNA全长序列为1 705 bp,包含387 bp的5′UTR序列,1 307 bp的3′UTR序列和855 bp开放阅读框(ORF)。其ORF编码284个氨基酸。系统进化分析表明普通草鱼与斑马鱼、墨西哥脂鲤的原肌球蛋白基因核苷酸同源性分别是93%和87%,氨基酸同源性分别是96%和93%。在聚类上普通草鱼原肌球蛋白基因与其他鲤科鱼类同源性较高,表明亲缘关系最近,与传统分类相一致。Real time-PCR结果表明原肌球蛋白基因在所检测的普通草鱼和脆肉鲩7个组织中均有表达,原肌球蛋白基因在普通草鱼腹肌中表达最高,其次为前肠。原肌球蛋白基因在脆肉鲩腹肌中的表达低于普通草鱼,而脆肉鲩中肌肉、肝脏、肾脏、前肠、后肠中原肌球蛋白基因表达量大于普通草鱼相对应组织,但差异不显著。     

大黄鱼Rab11基因的克隆与表达分析

克隆了大黄鱼小G蛋白家族中的Rab11基因,测序查明其cDNA序列全长1373 bp,其中5’非编码区为129 bp,3’非编码区为587 bp,开放阅读框为657 bp,编码218个氨基酸;其氨基酸序列与罗非鱼、斑马鱼等鱼类Rab11蛋白序列同源性在95％左右,与人类、大熊猫等物种的同源性也达到90%以上。Rab11基因在大黄鱼脾脏、鳃、肾脏、皮肤、肝脏、血液、肠、心脏和胃9个组织中均有表达,在血液、肝脏中表达量最高,在胃中表达量最低;溶藻弧菌刺激后大黄鱼肝脏、肾脏和脾脏组织中Rab11基因的表达量均明显上调,提示Rab11在大黄鱼的抗病免疫反应中有着重要的作用。     

猪Akt1、Akt2基因克隆与组织表达图谱分析

为了得到长白猪蛋白激酶Akt1和Akt2基因序列并分析其表达模式,本研究使用RT-PCR方法,首先克隆了蛋白激酶Akt1和Akt2的cDNA.序列分析显示:长白猪Akt1基因的cDNA全长1461bp,编码具480个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠同源性达到97%以上.长白猪Akt2基因cDNA全长为1505bp,编码具481个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠的同源性高达97%以上.SMART分析表明,猪Akt1和Akt2蛋白均包含了与PI-3K结合的PH结构域及2个具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S_TKc结构域.RT-PCR检测结果显示:Akt1mRNA在垂体、心脏、肝脏、脾脏、肌肉组织中高表达,在大脑、小脑、肾脏表达丰度较低.Akt2则在小脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏和肌肉组织中高表达,而在大脑和肾脏中表达丰度较低.     

人RS21-C6基因的克隆及其原核表达

从小鼠胸腺细胞克隆的新基因RS21-C6的cDNA648bp与人表达序列标签(EST)数据库进行同源性比较,得到71个EST片段,通过EST拼接获得一致性序列,经设计引物,并采用RT-PCR方法,从人新生儿脐带血单个核细胞、肝脏、淋巴结及Jurkat细胞系cDNA中扩增出一700bp的片段,利用快速扩增cDNA末端(RACE)方法,扩增其5′和3′端序列,得到此基因的全长序列(1118bp),其中包含一个513bp的开放阅读框,编码170个氨基酸.该基因在核酸水平与小鼠基因的同源性为83%,其演绎蛋白水平的一致性为75%,相似性为83%.此基因的GenBank登录号为AF210430.此外,已成功表达此基因的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-RS21-C6融合蛋白,其表达量占总菌体蛋白的32.5%.     

草鱼过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)基因 cDNA序列的克隆及其组成型表达

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是核激素受体超家族成员之一,分α,β,γ 3个亚型,PPAR具有多种生物学效能,对其基因进行研究将有助于揭示草食性鱼类对营养物利用规律及其机制.通过简并引物克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PPAR基因cDNA核心序列,应用3'RACE技术扩增该序列的3'末端序列,并对其进行序列分析,最后用荧光定量PCR方法比较草鱼肝脏、脑、脾脏、肌肉、脂肪和心脏的PPARα、PPARβ和PPARγ基因mRNA相对表达水平.序列分析结果表明,草鱼PPARα、PPARβ和PPARy基因cDNA核心序列片段大小为631 bp,604 bp和651 bp,分别编码210、201和217个氨基酸,PPARy经3'RACE后共获得大小为1 331 bp的片段,编码337个氨基酸.草鱼与鲤鱼(Cyprinus carpio)、斑马鱼(Danio rerio)、鲈鱼(Lateolabrax japonicus)等鱼类PPAR氨基酸序列同源性很高,为71.4%～96.1%;与人(Homo sapiens)、大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)、牛(Bos taurus)等哺乳动物PPAR氨基酸序列的同源性也较高,为65.0%～77.6%;与非洲爪蟾(Xenopus laevis)等两栖动物PPAR氨基酸序列的同源性约为67.0%.荧光定量PCR结果表明,草鱼PPARα于肝脏,PPARβ于肝脏、肌肉和心脏,PPARγ于肝脏的表达相对较高.相同物种不同PPAR亚型的同源性较低,而不同物种同型PPAR同源性很高,反映了不同亚型在结构上的差异,这与其在功能上的差异是相一致的.     

黄犏牛与黄牛b-Boule基因编码区序列、结构、表达模式和睾丸组织表达水平的差异分析

Boule是动物精母细胞减数分裂过程中的必需蛋白,与精子发生减数分裂阻滞、雄性不育等密切相关.文中通过PCR扩增和克隆测序获得黄犏牛b-Boule基因的cDNA全序列,生物信息学分析发现黄犏牛b-Boule基因编码区全长885 bp,具有典型的RNA识别基序(RRM)和DAZ重复序列;与黄牛氨基酸序列的同源性为98.65%,仅在C-末端有4个氨基酸的差异,典型结构域的氨基酸序列和高级结构相同.RT-PCR发现b-Boule基因在黄牛和黄犏牛睾丸组织中特异表达,原位杂交显示b-Boule存在于初级精母细胞和次级精母细胞的细胞质中.荧光定量PCR发现黄牛睾丸组织中b-Boule基因表达水平显著高于黄犏牛(P<0.05),且黄犏牛精子发生减数分裂阻滞的表型与人、小鼠BDule基因表达缺失或降低引起的不育表型一致,因此推测b-Boule基因可能在精母细胞减数分裂过程中发挥重要作用,且与黄犏牛雄性不育有密切的关系.     

佛手GRAS基因的克隆及表达分析

利用抑制消减杂交法从芸香科柑橘属不耐寒植物佛手中分离得到了一个表达序列标签(EST)片段,结合RACE技术克隆获得该基因的1 669 bp序列,编码区长1 236 bp,编码413个氨基酸.通过Blastn同源序列比对分析,结果显示该基因与拟南芥已知的GRAS基因同源性较高;与GenBank数据库比对分析,表明该基因具有GRAS特有的保守结构域.因此,命名该基因为:CmsGRAS(GenBank登录号:JF440647).用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)的方法研究了该基因在低温胁迫处理下的表达特性,结果显示该基因在低温胁迫后的表达量有明显的变化.     

鳜鱼肥胖基因的克隆与组织表达

为了研究脊椎动物肥胖基因(obese gene, ob)结构与功能关系,利用PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肥胖基因全长序列:鳜鱼ob基因全长1 398 bp, 由2个外显子和1个内含子构成,其完整的开放阅读框由486 bp组成,编码161个氨基酸. 应用Genome Walker方法克隆得到一段长为357 bp的鳜鱼ob基因5′侧翼区序列,并利用相关软件预测其中具有多个保守的顺式调控元件. 我们将克隆得到的鳜鱼ob基因编码氨基酸序列leptin与其他物种leptin序列分别进行同源性比较,并构建系统进化树,发现虽然不同物种间leptin序列差异非常大,但进化树分析显示所有的leptin序列,包括哺乳动物、两栖动物和真骨鱼类,各自聚集成簇. 最后通过荧光实时定量PCR方法研究鳜鱼不同组织ob基因的表达水平,与哺乳动物ob基因主要在脂肪组织表达分布不同,鳜鱼ob基因在所有被检测组织中均有表达,在肝脏组织中大量表达,其次是脑,在肠道、脂肪、脾和肌肉中只有微量表达,说明鱼类ob基因的表达分布及其调控机制可能与哺乳动物存在差别.     

猪黑皮质素受体3和4基因克隆及分析

以长白猪(Landrace)大脑cDNA为模板,克隆长白猪黑皮质素受体3和4基因(MC3R和MC4R).序列分析显示:长白猪MC3R基因cDNA编码具319个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠和斑马鱼的氨基酸序列一致性分别为86.4%、83.3%、82%和69.7%;MC4R基因cDNA全长1175bp,编码具332个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠的氨基酸序列一致性高达94%以上,与斑马鱼MC4R氨基酸序列享有70.7%的同源性.序列分析显示,猪MC3R和MC4R基因都具有典型的七次跨膜结构域,和短的胞内环和胞外环,且在第五个跨膜域中保守的甲硫氨酸(M)分别替换为异亮氨酸(I)和缬氨酸(V).另外,在猪MC3R和MC4R中还鉴定到保守的半胱氨酸残基,第一个胞内环中保守的PMY基序和N末端的3个N-链接糖基化位点.组织表达图谱分析表明,MC3R主要在大脑和脾中高表达,而MC4R主要在六种检测的组织中都有表达,在肾中表达较弱.