梅花鹿鹿茸软骨细胞和间充质干细胞永生化细胞株的构建及鉴定

分离梅花鹿鹿茸软骨细胞和间充质干细胞,使用SV40 LT抗原慢病毒载体建立永生化软骨细胞和间充质干细胞系并鉴定。将含有SV40 LT基因片段的慢病毒载体,转染人胚肾细胞293T获得包装后的病毒粒子,感染鹿茸软骨细胞及间充质干细胞,连续传代培养,通过形态观察、细胞增殖、real-time PCR、甲苯胺蓝染色法和流式细胞术等方法检测SV40 LT抗原表达以及细胞性质。实验所建立的永生化鹿茸软骨细胞系与间充质干细胞系能够稳定传代并具有较强的体外增值活性。RT-PCR检测到SV40T抗原的表达,通过甲苯胺蓝染色法和流式细胞术鉴定所得细胞系具有原代细胞的基本性质。成功获得永生化的软骨细胞与间充质干细胞系,为后续鹿茸生长及发育研究奠定了基础。     

慢病毒载体介导SV40LT致人脐静脉内皮细胞永生化

为成功分离与鉴定人原代脐静脉内皮细胞,用猿猴病毒40大T抗原(SV40LT)异位表达建立永生化人脐静脉内皮细胞系。将含SV40LT cDNA片段的慢病毒载体,转染人原代脐静脉内皮细胞,连续传代培养。通过形态、细胞免疫组织化学、RT-PCR及管状成形试验进行原代及转染后细胞形态学和功能学鉴定及检测SV40大T抗原表达。结果SV40LT转染后的人脐静脉内皮细胞为扁平多角形或短梭状,呈单层铺路石状镶嵌排列。特异性表达Ⅷ因子、KDR、SV40LT表达,并具有管状成型能力。说明成功分离与鉴定永生化的脐静脉内皮细胞系,为后续血管靶向治疗奠定了基础。     

SV40T/pcDNA3.1重组质粒的构建及在肝细胞中的表达

构建重组质粒SV40T/pcDNA3.1,为建立永生化肝细胞系奠定基础。pcD2质粒经BamH Ⅰ单酶切获得SV40T基因片段,并将其捕入pcDNA3.1载体,经酶切鉴定证实,SV40T基因片段已成功插入载体中,采用常规方法分离培养肝细胞,用SV40T单克隆抗体进行间接免疫荧光检测,验证其在肝细胞中的表达。     

小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定

构建小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体,检测人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)感染Sirt3基因过表达慢病毒后Sirt3 mRNA和蛋白的表达,为在细胞和动物水平研究Sirt3的作用提供新的途径和工具。利用Genebank检索的小鼠Sirt3基因序列,人工合成法合成小鼠Sirt3基因的c DNA片段,将其克隆至慢病毒载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP中,构建慢病毒表达质粒。进行酶切及测序验证后,将慢病毒表达质粒连同辅助包装原件载体质粒共同转染入293T细胞,收集上清,测定病毒滴度。用Sirt3基因过表达慢病毒感染SK-N-SH细胞,即为Sirt3过表达组(Sirt3);用空载体慢病毒感染的SK-N-SH细胞为空载体组(GFP);未感染病毒的SK-N-SH细胞为对照组(CON)。收集细胞后,用Real-time PCR法检测各组细胞Sirt3 mRNA的水平;用Western blotting法检测各组细胞Sirt3蛋白的表达。Sirt3基因过表达慢病毒载体构建成功,病毒滴度为1.0×10~9TU/m L。Sirt3组SK-N-SH细胞的Sirt3 mRNA和Sirt3蛋白水平均显著高于GFP组和CON组(P0.01)。成功构建的Sirt3基因过表达慢病毒载体具备高效感染力,能在SK-N-SH细胞高效过表达Sirt3,本研究结果为今后进一步在神经细胞和模型动物中研究Sirt3的作用提供了新的途径和工具。     

构建逆转录病毒PBabepuro-Bcl-2表达质粒及稳定转染细胞株

目的:构建pBabepuro-Bcl-2逆转录病毒表达质粒,鉴定表达,在小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中建立过表达Bcl-2稳定转染细胞。方法:以人上皮细胞的cDNA为模板,利用X-tremeGENE HP(Roche)转染293T细胞,蛋白质免疫印迹法在蛋白水平检测表达,利用逆转录病毒感染NIH3T3细胞。结果:成功构建了逆转录病毒表达质粒pBabepuro-BCl-2,蛋白水平检测证实其在293T细胞可以有效地表达,成功建立了过表达Bcl-2的NIH3T3稳定转染细胞。结论:通过构建pBabepuro表达质粒及在NIH3T3建立过表达Bcl-2稳定转染细胞,为进一步研究Bcl-2的功能调控奠定了基础。     

LITAF基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：探讨构建人脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子(LITAF)基因的过表达慢病毒载体的技术方法并检测其体外表达目的基因的水平。方法：设计LITAF基因引物,应用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增LITAF基因片段,应用EcoRI、BamHI酶切LV8载体,通过连接酶将LITAF基因片段连接至线性化的LV8载体上,应用酶切及测序方法鉴定LITAF-LV8重组质粒。将其包装慢病毒后感染293T细胞(人胚肾细胞),观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,验证后感染肝癌细胞株HepG2。RT-PCR和Western-blot鉴定感染后HepG2中LITAF的表达。结果：LITAF基因在慢病毒感染的HepG2细胞中的表达显著高于对照组细胞。结论：成功构建了过表达LITAF的HepG2细胞株,为后期研究提供了实验基础。     

脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

探讨构建人脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子(LITAF)基因的过表达慢病毒载体的技术方法,并检测其体外表达目的基因的水平。设计LITAF基因引物,应用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增LITAF基因片段;应用EcoRI、Bam HI酶切LV8载体,通过连接酶将LITAF基因片段连接至线性化的LV8载体上,应用酶切及测序方法鉴定LITAF-LV8重组质粒,将其包装慢病毒后感染293T细胞(人胚肾细胞),观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,验证后感染肝癌细胞株HepG2。RT-PCR和Westernblot鉴定感染后HepG2中LITAF的表达。LITAF基因在慢病毒感染的HepG2细胞中的表达显著高于对照组细胞。说明成功构建了过表达LITAF的HepG2细胞株,为后期研究提供了实验基础。     

Npas4基因过表达慢病毒的构建及其在SK-N-SH细胞的表达

研究旨在构建Npas4基因过表达慢病毒,为进一步深入探索Npas4基因的功能奠定基础。用人工合成大鼠Npas4基因c DNA片段,将其插入p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP构建慢病毒表达质粒p CDH-Npas4。酶切、测序验证质粒后,将p CDHNpas4和辅助质粒共转染包装细胞293T,浓缩上清得病毒颗粒并测定病毒滴度。取病毒颗粒感染SK-N-SH细胞48 h,收集细胞采用Western blotting法检测Npas4蛋白的表达。p CDH-Npas4携载正确Npas4基因,将其包装293T细胞后能产生病毒。病毒滴度为1.05×109TU/m L。相比于转染GFP病毒对照组(GFP)和未转染对照组(control),Npas4重组慢病毒组(Npas4)的细胞Npas4蛋白表达显著增高。成功构建Npas4基因过表达的重组慢病毒载体p CDH-Npas4,并获得高效的重组慢病毒,能将外源Npas4基因导入SK-N-SH细胞,为进一步研究Npas4基因的相关功能奠定了基础。     

cnksr2基因干扰腺病毒的构建及鉴定

构建小鼠cnksr2基因干扰腺病毒质粒载体并加以鉴定.根据小鼠cnksr2基因序列设计cnksr2干扰序列引物,定向克隆至穿梭载体pshuttle-H1的BglⅡ和HindⅢ位点,PmeⅠ酶切线性化的pShuttle-H1-Sicnksr2干扰质粒,并与腺病毒载体(pAdEasy-1质粒)共同转化E.coli BJ5183感受态细菌,产生重组腺病毒载体.用PacⅠ酶切线性化的回收质粒,转染293A细胞,包装腺病毒颗粒,在倒置显微镜下观察细胞病理性变化(Cell pathological effect,CPE),用TCID50法测定病毒颗粒的浓度,并初步观察病毒感染PC12细胞对目的基因的干扰效率.经酶切鉴定、测序证实成功构建小鼠cnksr2基因干扰腺病毒载体.包装的腺病毒浓缩悬液滴度为3.98×107PFU/mL.cnksr2在大鼠及小鼠中具有保守性,该病毒能在大鼠来源的PC12细胞中成功表达,并且对cnksr2基因干扰效率达50%以上.结论:成功构建了小鼠cnksr2基因的干扰腺病毒载体.     

慢病毒介导稳定表达HBcAg的P815/c细胞株的建立及鉴定

研究旨在建立稳定表达HBcAg的P815/c細胞株,为评价针对HBcAg的乙肝疫苗的免疫效果提供体外感染的细胞模型。通过构建携带HBcAg基因的慢病毒表达载体质粒pLenti-Ubc-HBcAg-EGFP-3FLAG4RES-Puro,载体质粒携帯有加强型绿色荧光蛋白(eGFP)及嘌呤霉素(Puromycin)抗性标记基因,与包装质粒pLP1、pLP2以及包膜质粒pLP/VSVG共转染人胚肾293T细胞进行包装,得到携帯有HBcAg基因的重组慢病毒颗粒LV-HBcAg-Puro。经纯化、鉴定后转染小鼠肥大瘤细胞株P815细胞72h后,通过加入并维持2μg/mL的嘌呤霉素杀死未被有效感染的细胞,药物筛选约10 d后,免疫荧光及流式细胞仪检测表达GFP的细胞比例在98%以上,Western Blot可检测到转染后细胞内HBcAg的蛋白表达。成功构建稳定表达HBcAg基因的细胞株P815/C,为研究小鼠体内针对HBcAg的疫苗诱发的CTL反应提供了细胞杀伤实验的靶细胞。     

稳定表达Cytoglobin的肝细胞株LO-2的建立及生长增殖的变化

目的:建立过表达细胞珠蛋白Cytoglobin(CYGB)的人肝细胞LO-2稳定株,初步探究CYGB对LO-2细胞生长增殖的影响.方法:采用PCR法扩增CYGB编码基因,并通过GATEWAY克隆技术构建慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB;酶切、测序鉴定后,与包装质粒三质粒共转人肾上皮细胞(HEK293T),收集、浓缩含病毒上清,获得病毒颗粒;感染LO-2细胞并采用流式细胞分选技术筛选稳定细胞株,Western blot检测表达情况;使用CCK-8试剂盒检测过表达CYGB对LO-2细胞增殖的影响,通过流式细胞技术检测过表达CYGB对LO-2细胞凋亡的影响.结果:慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB双酶切鉴定以及基因序列比对鉴定均正确.三质粒共转HEK293T细胞后,荧光显微镜下观察大部分细胞出现绿色荧光;收集病毒颗粒并感染LO-2细胞后,经流式细胞分选技术筛选获得稳定表达CYGB的细胞,Western blot鉴定显示,LO-2稳定株组的CYGB表达条带明显,阴性对照组未出现条带.CCK-8法绘制的细胞生长曲线显示,稳定表达细胞组的细胞生长速率低于阴性对照组,有统计学差异(P0.01).流式细胞技术检测各组LO-2细胞凋亡情况结果显示,稳定表达细胞组的细胞凋亡百分比高于阴性对照组(P0.05).结论:成功构建慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB;建立稳定表达CYGB的人肝细胞株LO-2-GFP-CYGB以及阴性对照组细胞株LO-2-GFP;稳定表达CYGB的肝细胞生长速率较阴性对照组肝细胞降低,稳定表达CYGB的肝细胞凋亡百分比高于阴性对照组肝细胞;为CYGB与其蛋白的相互关系研究提供了细胞模型.     

SARS-CoV-2 Spike蛋白诱导人肾上皮细胞周期阻滞及细胞凋亡

目的:初步探讨慢病毒载体介导的SARS-CoV-2 Spike蛋白(简称S蛋白)过表达对人肾上皮细胞生长的影响及相关机制.方法:构建S蛋白慢病毒的表达载体pLV-CMV-S-IRES-eGFP,并将此载体包装成慢病毒颗粒(LV-S).利用重组的慢病毒LV-S感染人肾小管上皮细胞(HK-2)及HEK293T细胞(293T),利用EdU测定其细胞活力,利用流式细胞术测定其细胞周期和细胞凋亡,并通过Western blot检测相关蛋白表达水平.结果:重组慢病毒载体感染HK-2及293T细胞24 h均能观察到eGFP表达,细胞活力检测结果显示S蛋白过表达可以使HK-2及293T细胞的细胞活力下降.流式细胞术结果显示S蛋白诱导细胞周期阻滞在G2/M期,同时S蛋白通过激活Caspase-3和Caspase-9诱导细胞发生凋亡.此外,SARS-CoV-2 S蛋白过表达可以增强HK-2及293T细胞自噬相关蛋白的表达.结论:SARS-CoV-2 S蛋白可能通过诱导肾上皮细胞发生周期阻滞和凋亡,介导细胞损伤.     

B2SINE RNA和HEXIM1蛋白相互作用的研究

构建了带FLAG多肽标签的hHEXIM1( HMBA-inducible protein 1)蛋白真核表达载体,在人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293 cells)中检测蛋白表达正确后,将该质粒转入小鼠的成纤维细胞(NIH3T3细胞)中,进行anti-FLAG的免...     

CD226分子siRNA慢病毒载体的构建和鉴定

为设计筛选针对人CD226分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对Jurkat/E6细胞膜表面天然CD226分子表达水平的影响,首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与CD226分子真核表达载体共同转染293T细胞,挑选出最有效抑制CD226表达的序列。应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因CD226的siRNA慢病毒载体。使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清,感染Jurkat/E6细胞系,对病毒感染效果进行检测。结果在4条针对CD226分子设计的siRNA序列中,siRNA—513最为有效的抑制了外源性CD226分子的表达,带有该序列的慢病毒载体pLKO—CD226可以完全抑制Jurkat/E6细胞上天然分子的表达。说明应用基因工程技术成功构建了针对CD226分子的RNA干扰慢病毒载体,为深入研究人类黏附分子CD226在机体免疫功能方面提供了技术支持。     

鲤IGF2b基因内含子的克隆、基因组序列分析及慢病毒载体构建

 为了了解鲤IGF2b基因与鲤生长性状之间的关系,以建鲤为试验材料,克隆了IGF2b基因内含子,分析其基因组序列的特点,构建了IGF2基因的慢病毒载体,同时观察其在293T细胞中的表达活性。结果获得鲤IGF2b 5 173 bp长度的基因组DNA序列(HM755899),共有3个内含子,4个外显子;在3′非翻译区存在2个CpG岛,在5′端非翻译区存在(T)n重复序列;除此之外,成功构建了慢病毒载体质粒Lenti-IGF2b-IRES-EGFP,转染293T细胞后,产生的重组慢病毒颗粒出现高表达绿色荧光,荧光定量PCR检测发现IGF2b基因在293T细胞中高表达。这些结果将为研究IGF2b基因在多态性、表达方面与鲤生长性状之间的关联奠定基础。     

GGPPS基因干扰腺病毒载体的构建及鉴定

构建GGPPS基因干扰腺病毒质粒载体并加以鉴定.根据GGPPS基因序列设计GGPPS干扰序列引物,定向克隆至穿梭载体pshuttle-H1的BglⅡ和HindⅢ位点,PmeⅠ酶切线性化的pShuttle-H1-SiGGPPS干扰质粒,并与腺病毒载体(pAdEasy-1质粒)共同转化E.coli BJ5183感受态细菌,产生重组腺病毒载体.用PacⅠ酶切线性化的回收质粒,转染293A细胞包装腺病毒颗粒,在倒置显微镜下观察细胞CPE,用TCID50法测定病毒颗粒的浓度,并初步观察病毒感染PC12细胞对目的基因的干扰效率.经酶切鉴定、测序证实成功构建GGPPS基因干扰腺病毒载体.包装的腺病毒浓缩悬液滴度为1.995×107PFU/mL.GGPPS在人中具有保守性,该病毒能在人源的WRL-68细胞中成功表达,并且对GGPPS基因干扰效率达70%以上.     

FTO过表达对小鼠胰岛β细胞功能的影响以及全基因组表达谱变化研究

为了研究肥胖基因FTO过表达对小鼠胰岛β细胞功能的影响以及基因表达谱的变化,构建小鼠FTO基因过表达慢病毒载体,包装慢病毒颗粒并感染小鼠胰岛MIN6细胞.利用QPCR和WesternBlot技术检测FTO基因在MIN6细胞中过表达情况,并检测葡萄糖刺激检测胰岛素的释放情况,进一步利用小鼠全基因芯片检测FTO过表达对小鼠胰岛MIN6细胞表达谱的影响.结果表明：慢病毒载体成功介导了FTO在MIN6细胞中过表达,FTO过表达可以显著抑制MIN6细胞的胰岛素释放.表达芯片的结果显示FTO改变MIN6细胞表达谱,发现多达922个的差异基因.FTO过表达改变了小鼠胰岛细胞的表达谱,差异基因通过一些重要信号通路影响小鼠胰岛β细胞的生物学功能.     

慢病毒介导MCF-7细胞中FOXP2基因沉默体系的建立

为了实现FOXP2基因在MCF-7细胞中稳定低表达,采用基因工程的方法构建pMAGic7.1-shFOXP2慢病毒干扰载体,并将其与辅助质粒共转染HEK293T细胞,包装shFOXP2干扰慢病毒,收取病毒上清加入到MCF-7细胞中,培养48h,荧光定量PCR检测FOXP2的基因mRNA表达水平,Western Blotting检测FOXP2蛋白表达水平.获得了pMAGic7.1-shFOXP2干扰载体,从而成功建立FOXP2基因稳定干扰的MCF-7细胞株,为进一步研究FOXP2在乳腺癌发生发展中的功能提供了研究材料.     

Cyclin E分子siRNA慢病毒载体的构建及其对骨肉瘤细胞系sosp9607的影响

设计筛选针对人cyclin E分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对骨肉瘤细胞系Sosp9607胞内cyclin E分子表达水平的影响.首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与cyclin E分子真核表达载体共同转染293T细胞.挑选出最有效抑制cyclin E表达的序列,应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因cyclin E的siRNA慢病毒载体pLKO-CE.使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收获病毒上清,感染Sosp9607细胞系,对病毒感染后抑制cyclinE表达的效果进行检测.结果在4条针对cyclin E分子设计的siRNA序列中,siRNA-464最为有效的抑制了外源性cyclin E分子的表达;带有该序列的慢病毒载体pLKO-CE可以完全抑制Sosp9607细胞中天然分子的表达,引起Sosp9607细胞生物学行为的改变:G1期细胞增多,S期减少,细胞增殖受抑制.说明应用基因工程技术成功构建了针对cyclin E分子的RNA干扰慢病毒载体,可有效抑制骨肉瘤细胞cyclin E的表达,使肿瘤细胞增殖减缓,为深入研究针对cyclin E的基因治疗方案的临床前实验研究提供了实验证据和理论依据.     

表达大鼠FoxA1的慢病毒制备和鉴定

通过PCR扩增获得大鼠FoxA1的cDNA,构建慢病毒重组载体plv-rFoxA1-IRES-EGFP,并瞬时转染293T细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及Western blot检测FoxA1的表达.通过钙转将该重组载体与辅助质粒△8.91,pVSV-G共转染293T细胞制备慢病毒.研究结果表明,大鼠FoxA1慢病毒质粒成功构建,并且证实所制备的慢病毒能感染细胞,使细胞有效表达FoxA1蛋白,为FoxA1的功能研究奠定了材料基础.