细胞选择性穿膜肽的穿膜效果研究

细胞穿膜肽是一类能够穿透细胞膜并且不损坏细胞膜结构的小分子多肽,该多肽一般由不多于30个氨基酸组成.针对FITC标记的具有肺癌或肝癌细胞选择性的两种穿膜肽,设置不同浓度梯度,分别处理多种肿瘤细胞,荧光显微镜下观察不同作用浓度下细胞中绿色荧光的强弱,并通过流式细胞仪检测含有荧光的细胞数.结果表明:两种细胞穿膜肽具有不同的细胞选择性. CPP33在作用浓度为10μmol/L时能观察到较强的荧光选择性,流式细胞仪检测含有荧光的细胞数约大于50%,CPP44在作用浓度为10μmol/L时能观察到较强的荧光选择性,流式细胞仪检测含有荧光的细胞数约大于60%.并且随着作用浓度的增加,两种细胞中含有荧光的细胞数不断上升.因此这种针对肿瘤细胞的选择性穿膜肽可能为小分子药物在体内的精确递送提供一种新的方法.     

R9-FOXM1(1-234aa)重组蛋白批量纯化及其抑瘤效应研究

通过基因工程构建重组表达质粒pET15b-R9-FOXM1(1-234aa),转化大肠杆菌建立构建表达R9-FOXM1(1-234aa)的菌株.采用原核表达系统和His-tag亲和纯化手段,规模化制备纯化穿膜肽R9-FOXM1(1-234aa),获得的蛋白的纯度达到90%以上.用R9-FOXM1(1-234aa)穿膜肽处理不同的肿瘤细胞,通过MTT实验研究其细胞效应.结果显示:当R9-FOXM1(1-234aa)穿膜肽的浓度达到2mM时,肿瘤细胞的死亡率为50%左右.实验表明穿膜肽R9-FOXM1(1-234aa)抑制不同肿瘤细胞的生长,有可能成为治疗肿瘤的潜在蛋白类药物.     

FOXM1688-748结构域相互作用蛋白的鉴定

为了鉴定转录因子FOXM1转录激活结构域(C-端第688位到748位氨基酸序列)的互作蛋白,以FOXM1的cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法扩增获得其转录激活结构域序列,克隆进入原核表达载体pGEX-4T2;利用大肠杆菌原核表达获得融合谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)标签的重组蛋白GST-FOXM1688-748;通过GST-pulldown结合质谱方法鉴定FOXM1688-748的互作蛋白,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T2-FOXM1688-748,获得了原核表达的重组蛋白GST-FOXM1688-748.将质谱鉴定获得的互作蛋白进行分析和归类,预示一些互作蛋白可以参与激活FOXM1的转录活性,如RPN2、MISP、MCM7蛋白,一些互作蛋白可以参与调控FOXM1蛋白的稳定性,如USP9Y、CUL4A、HSPB1、BAG2蛋白.FOXM1蛋白的转录激活结构域与许多不同功能的蛋白发生相互作用,暗示该结构域具有重要的分子生物学作用,期望为以FOXM1为靶点的临床药物研发提供实验依据.     

转录因子FOXM1剪接异构体在乳腺癌EMT过程中的初步研究

探究转录因子FOXM1不同的剪接异构体对乳腺癌EMT过程中的影响.采用基因工程方法分别构建了表达FOXM1B-EGFP和FOXM1C-EGFP两种FOXM1剪接异构体真核表达质粒,并将其转染进乳腺癌细胞,采用RT-PCR和Western印迹检测细胞样本中FOXM1剪接异构体的表达和EMT相关基因表达,同时采用transwell检测高表达不同FOXM1剪接异构体细胞的侵袭和迁移能力.成功构建了FOXM1B-EGFP和FOXM1CEGFP真核表达质粒.外源FOXM1B在乳腺癌间质型细胞的表达高于上皮型细胞,并主要存在于细胞核内,且高表达FOXM1B能够显著促进乳腺癌细胞的侵袭和EMT过程.外源FOXM1C在乳腺癌上皮型细胞中的表达高于间质型细胞,并且在细胞核和细胞质中均有表达,高表达FOXM1C能够显著抑制细胞的侵袭和EMT过程.实验结果表明,在乳腺癌细胞中,FOXM1B主要存在于细胞核内,FOXM1C在细胞核和细胞质中均有表达.本研究预示FOXM1B和FOXM1C对乳腺癌细胞EMT过程发挥不同的影响.     

人FOXA1蛋白的原核表达、纯化及蛋白互作分析

构建FOXA1的原核表达载体,诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段,为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA,逆转录成cDNA,设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段,分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21Rosetta DE3,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育,进行GST-Pull down试验,检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX-4T-1-FOXA1-C和pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表达载体;在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C与N端蛋白片段GSTFOXA1-N;证实GST-FOXA1-C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.     

如何更好发挥价格监督管理职能的分析与思考

成本管理中心为单位项目成本支出控制起到了较好的作用。但随着时代的进步以及市场的变化，控制效果逐渐降低，为了使该职能机构继续发挥良好的控制作用，在对现行状况进行分析后，提出一些改进措施和建议。     

抗肿瘤多肽M1-21的剂型优化

通过去溶剂化方法,将单体抗肿瘤多肽 M1-21纳米化,形成 50 nm 左右大小的多肽纳米颗粒（Nano-M1-21）. 运用动态光色散技术（DLS）和低压透射电镜（TEM）对 Nano-M1-21进行表征,并进行体外 37 ℃条件下颗粒稳定性测试 . 运用乳腺癌 MDA-MB-231、MCF-7和4T1 细胞验证 N...     

E-cadherin 启动子的荧光示踪体系的建立及验证

为实现对肺癌 A549 细胞的EMT 示踪,构建了 E-cadherin 基因启动子的慢病毒质粒,并与包装质粒pVSVG、Δ8.91 共转染 HEK293T 细胞,包装成有活性的慢病毒,收取病毒感染 A549 细胞,利用流式细胞仪和 Western blot 检测感染成功. 进一步用 TGF-β 诱导感染成功的 A549 细胞,通过在荧光显微镜下观察荧光变化、荧光定量 PCR 和 Western blot 检测GFP 和E-cadherin 的变化,发现在 TGF-β 诱导 48 h 后,A549 细胞形态由鹅卵石样变成长梭形. 并且荧光显微镜观察到相比较于未诱导的细胞,诱导后的A549 细胞绿色荧光明显变暗,同时 GFP 和 E-cadherin 的 RNA 水平和蛋白质表达水平均降低. 以 E-cadherin 基因启动子为基础建立了A549 细胞的EMT 荧光示踪体系,为进一步研究肺癌的 EMT 过程提供了材料.     

表达大鼠FoxA1的慢病毒制备和鉴定

通过PCR扩增获得大鼠FoxA1的cDNA,构建慢病毒重组载体plv-rFoxA1-IRES-EGFP,并瞬时转染293T细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及Western blot检测FoxA1的表达.通过钙转将该重组载体与辅助质粒△8.91,pVSV-G共转染293T细胞制备慢病毒.研究结果表明,大鼠FoxA1慢病毒质粒成功构建,并且证实所制备的慢病毒能感染细胞,使细胞有效表达FoxA1蛋白,为FoxA1的功能研究奠定了材料基础.     

慢病毒介导MCF-7细胞中FOXP2基因沉默体系的建立

为了实现FOXP2基因在MCF-7细胞中稳定低表达,采用基因工程的方法构建pMAGic7.1-shFOXP2慢病毒干扰载体,并将其与辅助质粒共转染HEK293T细胞,包装shFOXP2干扰慢病毒,收取病毒上清加入到MCF-7细胞中,培养48h,荧光定量PCR检测FOXP2的基因mRNA表达水平,Western Blotting检测FOXP2蛋白表达水平.获得了pMAGic7.1-shFOXP2干扰载体,从而成功建立FOXP2基因稳定干扰的MCF-7细胞株,为进一步研究FOXP2在乳腺癌发生发展中的功能提供了研究材料.