细胞选择性穿膜肽的穿膜效果研究

细胞穿膜肽是一类能够穿透细胞膜并且不损坏细胞膜结构的小分子多肽,该多肽一般由不多于30个氨基酸组成.针对FITC标记的具有肺癌或肝癌细胞选择性的两种穿膜肽,设置不同浓度梯度,分别处理多种肿瘤细胞,荧光显微镜下观察不同作用浓度下细胞中绿色荧光的强弱,并通过流式细胞仪检测含有荧光的细胞数.结果表明:两种细胞穿膜肽具有不同的细胞选择性. CPP33在作用浓度为10μmol/L时能观察到较强的荧光选择性,流式细胞仪检测含有荧光的细胞数约大于50%,CPP44在作用浓度为10μmol/L时能观察到较强的荧光选择性,流式细胞仪检测含有荧光的细胞数约大于60%.并且随着作用浓度的增加,两种细胞中含有荧光的细胞数不断上升.因此这种针对肿瘤细胞的选择性穿膜肽可能为小分子药物在体内的精确递送提供一种新的方法.     

FOXM1688-748结构域相互作用蛋白的鉴定

为了鉴定转录因子FOXM1转录激活结构域(C-端第688位到748位氨基酸序列)的互作蛋白,以FOXM1的cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法扩增获得其转录激活结构域序列,克隆进入原核表达载体pGEX-4T2;利用大肠杆菌原核表达获得融合谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)标签的重组蛋白GST-FOXM1688-748;通过GST-pulldown结合质谱方法鉴定FOXM1688-748的互作蛋白,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T2-FOXM1688-748,获得了原核表达的重组蛋白GST-FOXM1688-748.将质谱鉴定获得的互作蛋白进行分析和归类,预示一些互作蛋白可以参与激活FOXM1的转录活性,如RPN2、MISP、MCM7蛋白,一些互作蛋白可以参与调控FOXM1蛋白的稳定性,如USP9Y、CUL4A、HSPB1、BAG2蛋白.FOXM1蛋白的转录激活结构域与许多不同功能的蛋白发生相互作用,暗示该结构域具有重要的分子生物学作用,期望为以FOXM1为靶点的临床药物研发提供实验依据.     

E-cadherin 启动子的荧光示踪体系的建立及验证

为实现对肺癌 A549 细胞的EMT 示踪，构建了 E-cadherin 基因启动子的慢病毒质粒，并与包装质粒pVSVG、Δ8.91 共转染 HEK293T 细胞，包装成有活性的慢病毒，收取病毒感染 A549 细胞，利用流式细胞仪和 Western blot 检测感染成功. 进一步用 TGF-β 诱导感染成功的 A549 细胞，通过在荧光显微镜下观察荧光变化、荧光定量 PCR 和 Western blot 检测GFP 和E-cadherin 的变化，发现在 TGF-β 诱导 48 h 后，A549 细胞形态由鹅卵石样变成长梭形. 并且荧光显微镜观察到相比较于未诱导的细胞，诱导后的A549 细胞绿色荧光明显变暗，同时 GFP 和 E-cadherin 的 RNA 水平和蛋白质表达水平均降低. 以 E-cadherin 基因启动子为基础建立了A549 细胞的EMT 荧光示踪体系，为进一步研究肺癌的 EMT 过程提供了材料.