小鼠脂多糖应答蛋白mlrpS的载体构建及融合蛋白表达

为构建小鼠mlrpS-cDNA基因原核、真核表达载体,大肠杆菌表达其融合蛋白。采用反转录-聚合酶链反应从经脂多糖刺激的鼠NIH3T3细胞cDNA中,扩增出编码mlrpS的cDNA。用限制性内切酶KpnⅠand XhoⅠ消化后,插入原核表达载体pTAT中,经酶切鉴定与测序证实后,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株。异丙基β—D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产生融合蛋白。经KpnⅠ和XhoⅠ酶切回收mlrpS-cDNA,插入pcDNA3．1载体中;pcDNA3．1-mlrpS再经KpnⅠ和ApaⅠ酶切后,插入到pEGFP—c1载体上,构建pEGFP-mlrpS融合的真核表达载体。构建mlrpS表达载体经测序证实,与GenBank登录的序列完全一致;双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入载体pEGFP及pTAT;SDS—PAGE证实融合蛋白表达成功。说明：成功地构建了mlrpS原核、真核表达载体,成功正确表达了6His／mlrpS融合蛋白。     

pEGFP-N3-t-PA真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞中的表达

目的利用基因工程技术克隆人组织纤溶酶原激活物（t—PA）基因并构建一种能高效、安全表达t—PA的pEGFP—N3-t—PA真核表达重组质粒,为进一步研制转基因动物奠定基础．方法采用高效Trizol试剂快速从黑色素瘤细胞中提取总RNA,RT—PCR获得t—PAcDNA,并将真核表达质粒pEGFP—N3和t—PA基因片段分别双酶切,将回收的pEGFP—N3大片段（4．7kb）与t—PA基因片段（1．1kb）重组．对pEGFP—N3-t—PA质粒进行酶切鉴定和基因测序鉴定．脂质体介导pEGFP—N3-t—PA转染成纤维细胞（NIn313）,并用RT—PCR法从mRNA水平检测t—PA的表达情况,用倒置荧光显微镜检测、分析其在NH 3T3细胞中的表达．结果成功地从黑色素瘤细胞中克隆了t—PA基因,并构建了以pEGFP—N3为载体的真核表达质粒载体,并能在真核细胞中表达、分泌t—PA．结论含t—PA基因真核表达质粒构建成功．     

七鳃鳗PHB2的真核表达与亚细胞定位

以东北七鳃鳗心肌总RNA 反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增 PHB2基因全长CDS区,并将其定向克隆至真核表达载体 pEGFP‐N1上,构建真核重组载体pEGFP‐N1‐Lm‐PHB2．提取重组质粒,去除内毒素,利用脂质体介导的方法转染CHL、HeLa和MCF‐7细胞,通过Western Blot检测转染后 Lm‐PHB2是否表达,Confocal观察EGFP融合蛋白在细胞中的表达及亚细胞定位．结果表明：PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切和测序证明真核表达载体构建成功;Western Blot检测到Lm‐PHB2蛋白条带,Confocal观察到绿色荧光蛋白GFP ,证明真核重组载体成功表达;Lm‐PHB2蛋白主要定位在CHL细胞的细胞核,少量存在于基质和线粒体中,而在 HeLa和MCF‐7细胞中,Lm‐PHB2蛋白集中定位在细胞核中．本研究为七鳃鳗Lm‐PHB2的功能研究奠定了重要基础．     

一种新的产生天然蛋白的不依赖于连接的克隆载体

报道一种新的不依赖于连接的克隆（LIC）载体．该载体被缺刻的内切酶N．BbrCIA和限制性内切酶SwaI作用产生长的粘性末端．靶向基因的PCR片段在4mmol／LdGTP的孵育下被T4DNA聚合酶处理生成互补粘性末端．将处理过的载体和PCR产物共转化到大肠杆菌体内,插入载体的接合能够被宿主酶和给定的重组质粒修复．接着引入到大肠杆菌表达系统,该融合蛋白能够被表达和纯化,再用烟草蚀刻病毒TEV蛋白酶处理将移去靶蛋白的N末端,产生天然蛋白．两个基因,绿色荧光蛋白基因egfp和硫氧环蛋白基因txn已被用于这个系统．结果表明LIC策略对于高通量克隆和表达是高效的,对于天然蛋白的产生也同样高效．     

人细胞周期蛋白cyclin E基因的克隆与真核表达载体的构建

目的:为研究细胞周期蛋白在肿瘤形成过程的分子机制,构建带FLAG标签的细胞周期蛋白E的真核表达载体,并检测其在瞬时转染HeLa细胞株中的蛋白表达。方法:通过RT-PCR扩增cyclinE基因编码cDNA,并将扩增的cDNA片段插入p3XFLAG-CMVTM-14真核表达载体,重组子经酶切分析和测序鉴定后,用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染HeLa细胞,用Western-blot技术检测其在HeLa细胞中融合蛋白的表达。结果:经酶切鉴定和测序分析证实人cyclin E的真核表达载体构建成功,并能在瞬时转染的HeLa细胞中表达。结论:成功构建了人cyclin E的真核表达载体,为进一步研究细胞周期蛋白的功能奠定了基础。     

绿色荧光蛋白标记的NTE活性域表达载体的构建及表达 

利用含有特定限制性内切酶识别位点的引物，通过聚合酶链式反应扩增出人神经病靶标酯酶活性域的编码序列，经T载体克隆测序正确后，双酶切回收特异片段定向插入到增强型绿色荧光表达载体pEGFPN3中，通过酶切反应鉴定，构建了绿色荧光蛋白标记的神经病靶标酯酶活性域的融合表达载体pNESTEGFP。采用脂质体转染的方法将其转染到人神经瘤母瘤细胞SHSY5Y中，用荧光显微镜观察发现神经病靶标酯酶活性域分布于细胞质中，而且没有导致内质网膜的聚集，表明表达载体成功构建和表达。     

HPV16 E6基因真核表达载体的构建

本研究目的是构建HPV16 E6真核表达载体，为细胞转染研究E6蛋白和p53Arg或p53Pro蛋白的相互作用以及作用后对细胞功能的影响奠定基础。应用PCR技术从质粒pSP64-HPV16 E6上扩增出HPV16 E6片断。根据Kozak序列对真核蛋白表达的影响，设计2条引物扩增出2个HPV16 E6目的片断均插入真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A中，构建pcDNA3．1／myc-His（-）A．HPV16 E6重组质粒。研究结果显示：经酶切和测序鉴定克隆的基因片段为HPV16 E6 cDNA；建立了pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6重组质粒。这表明，已成功构建HPV16 E6真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6。     

EGFP和ALR融合基因表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达

从人血液中提取总DNA，利用PCR技术扩增人肝细胞再生增生因子基因，将其插入表达载体pEGFP—C1的多克隆位点中，构建增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein gene，EGFP）和人肝细胞再生增强因子（human augmenter of liver regeneration gene，ALR）融合基因表达载体pEGFP／ALR，并将其转染Hela细胞系，用含G418的DMEM／F12培养液筛选转基因细胞，然后利用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测转基因细胞中ALR基因的存在及其表达，用荧光显微镜检测EGFP基因的表达．结果显示：得到了构建正确的EGFP和ALR融合基因表达载体；在转基因细胞中，PCR扩增得到1．7Kb的ALR条带，蛋白电泳得到57KD大小条带．与ALR和EGFP融合蛋白大小相符；荧光显微镜下观察到发绿色荧光的Hela细胞．在转基因细胞中，EGFP和ALR同时存在并表达，绿色荧光蛋白可作为报告基因指示目的基因的表达，从而简化了目的基因繁琐的检测手段．     

Fractalkine基因真核表达质粒的构建及其在小鼠肝癌细胞中的表达

为克隆小鼠趋化因子Fractalkine(．FK)基因，构建真核表达质粒，并在小鼠肝癌细胞中表达，用以进行肿瘤的基因治疗，用RT-PCR法，从小鼠乳腺癌细胞D2F2扩增FK的cDNA，插入pCR2．1 TOPO载体，测序证实后，将其亚克隆至质粒pIRES中构建FK真核表达载体；用脂质体将重组质粒转染小鼠肝癌MM45 T．Li细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，用RT-PCR和免疫化学方法鉴定转染细胞中FK基因的表达．结果表明：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，RT-PCR和免疫化学方法证明转基因MM45T．Li细胞克隆中存在小鼠FK基因的表达。     

绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子逆转录病毒载体pLNOX-EGFP-C1-hri的构建及鉴定

构建表达重组绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的逆转录病毒载体pLNCX—EGFP-c1-hri，为探讨人核糖核酸酶抑制因子抗肿瘤作用机制打下基础．用亚克隆法，将目的片段egfp-c1—hri从表达载体pEGFP-C1-hri克隆到pLNCX上，用酶切筛选得到阳性克隆后，用脂质体法将其转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中，用800mg／L G418筛选2周后，在荧光显微镜下检测其表达．双酶切鉴定得到pLNCX-EGFP-C1-hri阳性克隆，荧光显微镜显示绿色荧光在B16细胞质中高效表达．成功构建逆转录病毒表达载体pLNCX—EGFP-C1-hri．     

含有重组人白细胞介素18基因的工程菌的产物表达和鉴定

0引言 1996年,Ushio等[1]从人的肝脏细胞中克隆了人的白细胞介素18(IL-18) cDNA,并在大肠杆菌中得到了表达.IL-18是国际上最新获得的细胞因子[2].     

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况。应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFP-N1真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定。将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果 CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达。成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达。     

人Rab26基因的克隆和表达

以完整EST为参考序列设计引物,以人的胎脑cDNA为模板,用PCR方法筛选获得Rab26基因全长序列,并亚克隆到载体pGEM-T,真核表达载体pEGFP-N1和原核表达载体pET．32a（＋）中,RT-PCR显示该基因在不同组织的肿瘤细胞株中表达量有明显的差异．把Rab26基因转染入HeLa细胞中,通过与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合表达,显示Rab26定位于胞内膜性细胞器上．在大肠杆菌表达系统获得Rab26基因的高表达．这些结果为进一步研究Rab26基因在细胞内吞和运输功能等方面打下了基础．     

长叶车前花叶病毒上海株(RMVsh)外壳蛋白基因的克隆、序列分析及原核表达

长叶车前花叶病毒上海分离株（RMVsh)是从上海郊区的青菜（Brassica chinensis)上分离鉴定的，以提纯的病毒为材料，SDS－酚法纯化的基因组RNA作为模板，通过RT－PCR方法克服了该病毒的外壳蛋白基因（CP），DNA序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长474个碱基，编码157个氨基酸，将CP基因插入原核表达载体pBAD/His-C中，转化E.coli Top10后，诱导表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈－特异性的蛋白条带，Western blot检测表明，表达产物与RMVsh抗血清呈阳性反应，RMVsh CP基因的核苷酸序列及氨基酸序列与烟草花叶病毒属中其他能侵染十字花科作物的成员相比，同源率分别为83．5％－98．9％和87．9％－99．4％，并讨论了RMVsh的分类地位为烟草花叶病毒属侵染十字花科植物2个亚组中的第一亚组的代表。     

胰岛自身抗原GAD65片段和胰岛素B链基因共表达DNA疫苗的构建与表达

构建两种胰岛自身抗原谷氨酸脱羧酶（ glutamic acid decarboxylase, GAD） 65片段与胰岛素B链基因共表达DNA疫苗,并检测其在体外COS-7细胞中的表达。PCR方法从GAD65质粒中扩增出GAD190-385和GAD490-570两个片段的cDNA,overlap法再分别与信号肽基因进行拼接,将拼接后的融合基因SGAD190-515和SGAD490-570分别与胰岛素B链基因依次克隆入双启动子真核表达载体pBudCFA．1中。重组质粒经酶切和测序鉴定后,脂质体体外转染COS-7细胞,Western blot方法检测目的基因在该细胞中的表达。结果表明核酸序列测定克隆的融合基因和胰岛素B链基因序列与报告序列一致,开放阅读框正确,Western blot显示转染了DNA疫苗的COS-7细胞中均可检测两个目的基因的表达。两种GAD65片段与胰岛素B链基因共表达DNA疫苗均成功构建,为自身免疫糖尿病的免疫干预研究奠定了实验基础。     

结核分枝杆菌mpt64基因真核表达载体的构建及表达

构建结核分枝杆菌分泌蛋白mpt64基因真核表达载体。通过PCR法从MTBH37Rv株基因组中扩增mpt64基因,插入pGEM-T-easy载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（-）,重组质粒酶切鉴定正确后,以Lipo-fectamine2000转染COS-7细胞后,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。构建了真核表达载体pcDNA-mpt64,RT-PCR结果证明mpt64基因可在COS-7细胞中转录,用间接免疫荧光检测,有表达mpt64蛋白的细胞着染。结果表明,构建结核分枝杆菌mpt64基因的真核表达载体pcDNA-mpt64成功,mpt64基因可以在COS-7细胞中表达。     

Cloning and Expression of Recombinant Human Thymosin in Yeast Pichia pastoris

The gene of human thyrnosin alpha 1 (hT(1)was synthesised according to favorite eodons of Pichia pastoris by PCR. N-terminal 28 amino acid residues of 40S ribosomal protein (RP), S24Ethat is N-aeetylserine were replaced by hT( 1 for the constitution of hT(1-RP fusion gene in order to express acetyllated thyrnosin α1. And also, the Asn-Gly bond was designed to faeiliate isolation of the target protein. The fusion gene was cloned into the expression vector, pPIC/gK. The constructs were transformed into HIS4 mutant strain GS115 by eleetroporation. Both SDS-PAGE analysis and Western blot analysis indicated that the fusion protein was expressed successfully.     

中国白兔IL-6基因的分子克隆及其表达研究

运用RT-PCR技术对用ConA刺激的中国白兔外周血淋巴细胞(PMBCr)进行了扩增,将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果中国白兔IL-6基因全长726 bp,编码242个氨基酸,其中前26个氨基酸残基构成信号肽序列.与不同物种IL-6基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列有一定的差异.在推导的中国白兔IL-6氨基酸序列中,在108-110位存在1个潜在的N-联糖基化位点,同时存在9个Cys残基.将pTIL-6双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-6,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行了诱导.结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为29.5kDa的重组目的蛋白.经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的16.2%.     

A novel human gene spindlin1, encoding a protein localized in the cell nucleus and inducing NIH3T3 cell''s transformation

A novel human gene, spindlin1, recently cloned in our laboratory, is highly expressed in the tissue of ovary cancer. To study its biological function, a vector expressing green fluorescent-spindlin1 fusion protein was constructed and transfected into COS-7 and NIH3T3 cells by lipofectamine methods. The results showed that the fusion protein pEGFP-N1-spindlin1 was localized in the nucleus of COS-7 and NIH3T3 cells. NIH3T3 cells which could stably express spindlin1 as a result of RT-PCR analysis compared with the parental NIH3T3 cells displayed a complete morphological change, improved the cell growth and increased the percentage of cells in G2/M phase (12.6% vs control cells at 3.4%). Furthermore, overexpressed spindlin1 cells formed colonies in soft agar, more motile in migration assay in vitro and formed tumors in nude mice. Our findings provide direct evidence that spindlin1 gene may be a prooncogene which is associated with tumorigenesis.     

LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

为构建人LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达及定位,通过基因重组的方法构建LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体,并通过酶切和基因测序鉴定。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。经酶切和基因测序鉴定LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体构建成功。转染HEK293细胞后,荧光显微镜检测显示融合蛋白仅在细胞浆中表达。说明基因重组技术可成功构建LMP3／pEGFP-N3重组体真核表达载体,重组表达的融合蛋白仅存在于细胞浆内。