密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因(appA)全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因(appA-P),并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20~50℃、pH1.0~6.0范围内较稳定.     

两种重组真菌植酸酶的纯化及其酶学性质比较

对相同表达系统中产生的黑曲霉植酸酶(r-Anp)与烟曲霉植酸酶(r-Afp)的酶学特性进行了比较.两者的Km值都较低，但r-Anp的Vmax值远高于r-Afp（102.5 vs. 29.5 μmol·mg-1·min-1，P＜0.05）.r-Anp在pH 2.5仍具有植酸酶活力，而r-Afp则丧失全部活性.差示扫描量热法(DSC)研究发现r-Afp的蛋白质解链温度（Tm）低于r-Anp（59.1 ℃ vs. 62.1 ℃)，但经热处理（90 ℃，20 min）后，前者残余更多的相对酶活（81% vs. 3     

宁夏区内抗旱牧草硝酸还原酶活力的比较研究

采用硝酸还原酶活力测定的活体法,对宁夏区内5种豆科抗旱牧草营养期的叶、茎、木质部中硝酸还原酶(NR)活力进行了分析.结果表明,在营养期,同一牧草的不同部位其NR活力有一定差异,叶>茎>木质部;不同牧草的NR活力也存在显著差异,羊柴>紫花苜蓿>沙打旺>柠条>胡枝子.     

钙对镉胁迫下小白菜生理特性的影响

以小白菜(Brassicachinensis L.)为研究对象,为探明外源钙能否缓解镉胁迫对小白菜造成的生理毒害.实验以蛭石和珍珠岩(2∶1)混合为栽培基质,以改进的Hoagland营养液(用硝酸铵代替硝酸钙)为营养源,对比研究了不同质量浓度(0,200,400,800 mg/L)钙对镉胁迫下小白菜根系活力、硝酸还原酶(NR)活性、硝态氮含量、光合色素含量等生理指标的影响.结果表明:1)镉胁迫使小白菜根系活力下降,NR活性降低,而硝态氮含量明显上升,光合色素合成明显受到影响;2)在钙处理下,根系活力显著提高(p<0.05),NR活性普遍上升,光合色素含量有所上升但普遍低于对照组;3)低钙组的光合色素含量明显高于无钙组,但是总体呈现下降趋势.硝态氮含量与NR活性成负相关,呈现先降后升的趋势;高浓度钙抑制根系活力与NR活性.因此,适当钙质量浓度(200~400 mg/L)处理可以明显缓解重金属镉对小白菜造成的生理胁迫.本研究结果为外源钙在缓解植物重金属毒害方面的应用提供理论依据.     

全植物蛋白饲料中添加植酸酶对草鱼生长、非特异性免疫及消化酶活力的影响

选用初始体重为( 39.68+3.05)g的草鱼作为试验对象,在全植物蛋白基础饲料中,设5个不同的植酸酶添加水平(500、750、1 000、1 250、2 500 U/kg),另设2个对照组,对照组I(D1):全植物蛋白基础饲料添加无机磷(Ca(H2P04)2),对照组2(D2):全植物蛋白基础饲料不添加植酸酶和无机磷,开展了为期8周的饲养试验.研究了植酸酶对草鱼生长、非特异免疫及消化酶活力的影响.结果表明:对照组1鱼体的特定生长率最大,FCR显著低于其它各组(P＜O.05);与对照组2相比,当植酸酶添加水平大于1 000 U/kg时,草鱼的饲料系数显著降低、蛋白质效率、特定生长率得到显著提高(P＜0.05).当植酸酶添加水平大于1 000 U/kg时,血清超氧化物歧化酶(SOD)活性显著大于对照组2(P＜0.05),对照组1的血清SOD活性显著高于其它各组(P＜0.05);血清及肝胰脏中各组碱性磷酸酶(AKP)活性无显著性差异(P＞O.05);添加植酸酶后肝胰脏中SOD活性增强,且当植酸酶含量为1 250 U/kg时,肝胰脏SOD活性显著高于对照组1和对照组2(P＜0.05).当植酸酶添加水平大于1 000 U/kg时,草鱼肝胰脏和肠道中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性都明显增强.结果得出,当植酸酶添加水平为1 000-1 250U/kg时,全植物蛋白饲料中添加植酸酶有助于草鱼的生长、非特异性免疫机能的提高,并能有效增强草鱼肝胰脏和肠道中的消化酶活性.     

植物硝酸还原酶的体内测定法

硝酸还原酶(NR)是植物氮素代谢中的关键酶,可作为植物育种和营养诊断的生化指标,近五年来我国在稻、麦、玉米等作物上,亦已揭示出NR活力与作物耐肥性呈负相关这一规律,因此测定NR活力的大小,能够反应作物耐肥性能的弱或强。硝酸还原酶的测定方法有体外法(in Vitro)及体内法两种,体外法测定的数据比较精     

利用酶法生产肌醇初步研究

植酸酶能将植酸及其二价盐类菲丁水解生成磷脂酰肌醇,在磷酸酯酶的继续作用下,磷脂酰肌醇被分解为肌醇。无花果曲霉能同时分泌植酸酶和磷酸酯酶。通过对无花果曲霉（Ａ．ｆｉｃｕｕｍＡ．ｓ３．３２４）产生植酸酶和磷酸酯酶条件的研究,在确定的最佳条件下,植酸酶和磷酸酯酶活力分别达到５．７ｕ／ｍＬ、０．５３３ｕ／ｍＬ。用所得发酵液水解菲丁制备肌醇,使肌醇的转化率达１０．３％。     

糖基化影响真菌植酸酶的胰蛋白酶耐受性

通过重叠聚合酶链式反应,将黑曲霉植酸酶(Aspergillus niger NRRL 3135phytase)第238~337位与第382~444位多肽片段的基因编码序列替换为烟曲霉植酸酶(Aspergillus fumigatus ATCC 13073phytase)中的对应序列,构建片段置换植酸酶(Fragments-replaced phytase)基因.将插入该基因的pGAPZαA重组质粒转化入毕赤酵母.通过离子交换与凝胶过滤纯化,获得重组酵母分泌的活性片段置换植酸酶.与黑曲霉植酸酶相比,片段置换显著提高了片段置换植酸酶的胰蛋白酶耐受性.而通过脱糖基化酶PNGase彻底去除N-糖基化,可恢复片段置换植酸酶对胰蛋白酶的敏感性.上述结果表明烟曲霉植酸酶对应片段上的N-糖基化修饰可显著提高毕赤酵母表达的黑曲霉植酸酶的胰蛋白酶耐受性.     

玉米叶片硝酸还原酶活性测定条件的优化

以玉米品种农大108幼苗为材料,研究了温度、pH值、叶位及一天中的不同时段对硝酸还原酶(NR)活性的影响,同时对光照及三氯乙酸(TCA)对NR的影响效应进行了评价。结果表明,玉米硝酸还原酶在24℃,pH 7.5下的活力最高;不同叶位,刚刚展开的叶片(心2叶)活性极显著高于其它叶位;NR在一天中的不同时段活性不同,以15:00的活性最高。不同测定条件下,与照光处理相比,黑暗条件下的酶活性显著提高。此外,加入变性剂三氯乙酸使玉米叶片内的NR活性明显减低。     

稀土异戊橡胶替代天然橡胶共混硫化胶的性能研究

研究了稀土异戊橡胶(Nd-IR)和天然橡胶(NR)的共混比对其硫化性能及力学机械性能的影响.研究结果表明:随着Nd-IR用量的增加,Nd-IR/NR共混胶的焦烧时间延长,硫化安全性提高;Nd-IR/NR共混硫化胶的拉伸强度、定伸应力和弹性以及老化后性能率略有下降,硬度(邵尔A)、断裂伸长率和磨耗性能有所提高;电子扫描显微镜(SEM)对共混胶形态分析表明,炭黑在Nd-IR/NR共混橡胶中均匀分散,没有出现团聚和微相分离现象.     

大肠杆菌植酸酶appA的融合表达及耐热性研究

提取大肠杆菌(SUGL)基因组DNA,通过PCR方法从基因组扩增得到植酸酶基因ap-pA,测序结果表明该基因的ORF读框包含1440个核苷酸.将该基因重组于大肠杆菌表达载体pET-32a(+)中,导入大肠杆菌BL21(DE3),构建工程菌BL21(DE3)-pET32a-appA.对表达条件进行了优化,在30℃下,以0.1mmol/L IPTG诱导表达植酸酶,表达量达到10%以上.在37℃,用钒钼酸铵法测定了表达的植酸酶活性为40740.7U/g,同时观察不同加热温度对植酸酶活性的影响程度.发现融合表达的     

Expression, purification and characterization of a phyAm-phyCs fusion phytase

The phyA^m gene encoding acid phytase and optimized neutral phytase phyCs gene were inserted into expression vector pPIC9K in correct orientation and transformed into Pichiapastoris in order to expand the pH profile ofphytase and decrease the cost of production. The fusion phytase phyA^m-phyCs gene was successfully overexpressed in P. pastoris as an active and extracellular phytase. The yield of total extracellular fusion phytase activity is （25.4±0.53） U/ml at the flask scale and （159.1±2.92） U/ml for high cell-density fermentation, respectively. Purified fusion phytase exhibits an optimal temperature at 55 ℃ and an optimal pH at 5.5-6.0 and its relative activity remains at a relatively high level of above 70% in the range ofpH 2.0 to 7.0. About 51% to 63% of its original activity remains after incubation at 75 ℃ to 95 ℃ for 10 min. Due to heavy glycosylation, the expressed fusion phytase shows a broad and diffuse band in SDS-PAGE （sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）. After deglycosylation by endoglycosidase H （EndoHf）, the enzyme has an apparent molecular size of 95 kDa. The characterization of the fusion phytase was compared with those ofphyCs andphyA^m.     

不同来源重组漆酶的酶学特性

以来源于变色栓菌的同工酶LacA、LacB、LacC,杂色云芝的同工酶Lcc1、Lcc2,以及细菌ARA等6种重组漆酶为研究对象,比较了它们的最适反应温度、最适反应pH、温度稳定性、pH稳定性、动力学常数K_m,以及Cu²⁺对漆酶酶活的影响等酶学特性。结果表明:以邻联甲苯胺为底物时,LacA、LacB、LacC、Lcc1、Lcc2、ARA的最适反应温度分别为60、60、70、60、55和75 ℃; 以愈创木酚为底物时,6种漆酶的最适反应pH分别为5.0、5.0、4.5、5.0、4.5、7.0。LacA在催化ABTS、愈创木酚、邻联甲苯胺、丁香醛连氮以及2,6-二甲基苯酚时,其最适反应温度分别为55、70、60、20、65 ℃。此外,真菌漆酶在30～60 ℃,pH为2.5～7.0范围内都有较好的稳定性,细菌来源的漆酶在80 ℃下保持60 min,在pH=7.0时保持6 h仍具有较高的酶活力。Cu²⁺对细菌漆酶的激活作用要明显高于真菌漆酶。同时,以ABTS为底物时,K_m值最小,且不同来源漆酶的K_m值相差不大。因此,6种不同来源的重组漆酶在催化同一种底物时,酶学特性存在着差异性,同一种重组漆酶在催化不同底物时,其酶学特性也有较大差异。     

芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

根据已知的枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得了长约1.1kb不含有信号肽序列的植酸酶phyC基因表达片段.经T载体克隆及序列测定后,构建毕赤巴斯德表达载体pPIC3.5K-phyC,并电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子,并进行了诱导表达.SDS-PAGE分析表明:表达产物分子量为42.01KD,表达量占细胞可溶性总蛋白的24%,并具有植酸酶的生物学活性.酶学性质分析结果显示:胞内表达的植酸酶酶促反应最适pH值为7.5;最适反应温度为70℃;经90℃处理10min,残留酶活性42% 均优于出发菌株天然植酸酶的相应性质.     

壳聚糖固定化蚯蚓纤溶酶及其性质

以壳聚糖为载体,戊二醛为交联荆,用吸附交联法固定蚯蚓纤溶酶,对蚯蚓纤溶酶的固定化条件及固定化酶的各种性质进行了研究,确定了酶固定的最适条件:1 g用pH为6.5的磷酸盐缓冲液浸泡的壳聚糖载体与5 mL体积分数为1%戊二醛在25℃交联8 h,充分洗去戊二醛之后,加入蚯蚓纤溶酶13 U,4℃吸附6 h,充分洗去未交联的游离酶,酶活力回收最高大约为63%,固定化酶的比活为0.082 U/mg.固定化酶,游离酶的最适温度均为50℃,游离酶的最适pH值为8.5,而固定化酶的最适pH值为8.0,固定化酶的热稳定性,pH稳定性均比游离酶有所提高,游离酶、固定化酶都能水解纤维蛋白原和纤维蛋白,固定化酶不再水解BSA.     

真菌嵌合体植酸酶的构建及其抗蛋白酶水解特性研究

 在烟曲霉植酸酶（Afp）的基因上,通过PCR逐步将编码1-47、178-237及338-381多肽序列的DNA片段置换为黑曲霉NRRL 3135植酸酶（Anp）中的对应片段,构建了3个嵌合体（嵌合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）基因,并在毕赤酵母中将其成功表达及纯化。所有的嵌合体和亲本植酸酶均能抵抗胃蛋白酶。在m(胰蛋白酶)/m(植酸酶)为0.1时,Anp完全失活;但Afp与所有嵌合体的活性仅损失13%~23%。胰蛋白酶水解产物的SDS-PAGE结果显示嵌合体Ⅱ与Ⅲ也能被胰蛋白酶严重水解,但非变性PAGE结果却表明它们在水解后仍能保持结构完整。嵌合体也具有一些与Anp及Afp相异的新pH曲线及耐热性。实验表明,通过替换基因片段改良真菌植酸酶可行。     

天然橡胶/杜仲胶复合材料的制备及其阻尼性能研究

在天然橡胶(NR)中引入杜仲胶(EUG),以环氧化天然橡胶(ENR)/受阻酚AO-80(质量比为25∶20)为阻尼相,制备了NR/EUG/ENR/AO-80复合材料,并测定了复合材料的硫化特性、力学性能、结晶性能与动态力学性能。结果表明：复合材料在常温范围内具有较高的损耗因子与较宽的阻尼温域,当NR与EUG的质量比为60∶40时复合材料具有最大的损耗因子峰值,并且随着EUG含量的增加,总体上复合材料在常温范围内的储能模量逐渐增大;复合材料的玻璃化转变温度出现在-60℃附近,并且随着EUG含量的增加,复合材料开始出现EUG结晶的熔融峰,结晶度和熔融温度逐渐增大。扫描电子显微镜(SEM)测试结果表明复合材料的断面较为平整,ENR改善了两相的相容性;透射电子显微镜(TEM)测试结果表明NR与EUG两相之间具有明显的分界。复合材料在低应变下表现出高柔性的特点,同时具有较高的拉伸强度和拉断伸长率。     

反式聚环戊烯橡胶在轮胎胎肩胶中的应用研究

对合成的3种不同相对分子质量的反式聚环戊烯橡胶（TPR）用于轮胎胎肩胶进行了研究,结果表明：与使用天然橡胶（NR）及顺丁橡胶（BR）/NR并用胶相比,TPR硫化胶的回弹性、老化性能、耐磨性和低温性能优异,耐疲劳性能好,动态生热低,滚动阻力小,抗湿滑性稍差,拉伸强度和撕裂性能较差;TPR/NR并用硫化胶与NR相比物理性能有所改善,耐老化性、耐磨性和低温性能优异,回弹性、耐疲劳性及动态生热相当,滚动阻力小,有较好的动态力学性能。相对分子质量较低的TPR2具有较佳的综合性能,TPR不适合单独应用于轮胎胎肩胶,其与NR并用具有较好效果。     

米根霉产脂肪酶的条件及酶学性质

对用于全细胞生物催化剂的米根霉菌株产酶条件的优化及脂肪酶的酶学性质进行了研究。结果表明,在250 mL三角瓶液体培养中,米根霉适宜的产酶条件为：氮源为2%胰蛋白胨与0.1%NaNO3复合,碳源为0.3%的大豆油,培养基初始pH=5.5,培养温度28℃,培养时间约58 h。酶学性质研究表明,所产脂肪酶的最适pH=7.5,最适温度为35℃,该酶在pH为7~9、温度低于40℃的范围内表现稳定,Mg2+对酶活力有一定促进作用。     

海洋极端微生物和极端酶分子生物学研究

分离自海洋极端微生物的极端酶具有超常的生物学稳定性，能够在极端温度、pH值、压力和离子强度下表现出生物学活性，因此海洋极端酶为生物催化和生物转化提供了良机。新的极端物种的发现、基因组序列的确定及基因工程技术的应用，加快了发现和制各新酶的进程。蛋白质工程和定向进化技术进一步改善酶的活性和特异性，促进了海洋极端酶的工业应用。对极端酶的分子生物学研究加深了人们对酶稳定性机制的理解，丰富了分子进化理论。