番茄抗白粉病必需基因ShGSTU1原核表达条件优化

采用RT-PCR技术从番茄中扩增谷光甘肽转移酶基因ShGSTU1,构建该基因的原核表达载体pET28aShGSTU1和pET32a-ShGSTU1,并对重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达条件进行优化,主要对诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度进行分析.结果表明:重组蛋白在表达载体pET28a中的最佳表达条件为1mmol/L IPTG,37℃诱导4h;在表达载体pET32a中的最佳表达条件为1mmol/L IPTG,30℃诱导5h.     

丙烯酰CoA合成酶在大肠杆菌中的表达及其酶活性表征

以橙色绿屈挠菌（Chloroflexus aurantiacus）dsm636基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆了丙烯酰CoA合成酶（ACS）基因,并连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建了pET-22b(+)-Acs重组质粒,测序结果100%正确。将重组质粒pET-22b(+) Acs转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建了大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-Acs基因工程菌。重组菌株经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,目标条带出现在分子量约160000处,表明丙烯酰CoA合成酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达;体外酶活实验证明,所表达的丙烯酰CoA合成酶是具有活性的。     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)糖基转移酶基因的克隆、序列分析及表达

为获得具有催化活性的糖基转移酶纯酶,本研究以短小芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用简并PCR技术扩增到基因(GT-A)全长序列.该序列全长1 287bp、编码423个氨基酸,分子量约为49.2KD.经序列分析,该基因属于糖基转移酶基因.根据GT-A基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达重组质粒GTA-pet28a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个约50kD的融合蛋白.纯化后测定其糖基转移酶活性,与37℃相比,80℃的反应温度其活性能提高3.4倍左右.研究结果表明,该酶是一种具有应用潜力的嗜高温糖基转移酶.     

苏云金芽孢杆菌BtR05普鲁兰酶基因pul在重组大肠杆菌中的自诱导表达

以苏云金芽孢杆菌BtR05基因组DNA为模板,PCR扩增得到其普鲁兰酶基因pul,构建了表达载体p ET(K)-Trx-pul,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中。用IPTG和自诱导表达系统分别对该酶基因进行诱导表达。Tricine-SDSPAGE结果表明,普鲁兰酶基因pul可通过自诱导获得大量表达。     

结核分枝杆菌RipB基因的克隆、表达及对藤黄微球菌生长的影响

提取肺结核分枝杆菌基因组DNA,PCR扩增RipB基因并将其连接到表达载体pET-21a上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,用IPTG诱导表达重组蛋白.SDSPAGE表明:重组RipB表达蛋白量约占菌体总蛋白量的40％,而其在37℃表达时主要为包涵体,在15℃表达时主要在可溶上清内;Ni柱一步亲和层析获得重组RipB;100 pmol/L重组RipB可显著促进藤黄微球菌生长.     

基于基因组的TEV蛋白酶的高表达

TEV蛋白酶由于其高酶切活性、酶切位点的专一性和酶切条件的宽容性而在蛋白分离和蛋白质组学研究等领域有着广泛的应用.目前获得TEV蛋白酶的方法是将克隆在质粒上的TEV基因在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中实现过表达.但本方法有一定缺点,如需使用抗生素,这就可能在后续的纯化中引入杂质,菌株群体中不均一性而降低产量等.本研究通过重组工程方法将受T7强启动子驱动的,与麦芽糖结合蛋白MBP融合的TEV蛋白酶基因整合至BL21(DE3)的基因组上进行过表达.MBP-TEV在细胞内自剪切获得分离的TEV.NiNTA亲和层析得到纯化的TEV,产量可达4.2 mg/L.所分离的TEV表达出良好的酶切活性.本菌株有着以之大规模获得TEV的潜力,所建立的通过重组工程将外源基因整合至BL21(DE3)基因组的进行表达的方法也可成为通用的平台技术.     

短小芽孢杆菌(Bacillus p umilus )糖基转移酶基因的克隆、序列分析及表达

为获得具有催化活性的糖基转移酶纯酶,本研究以短小芽孢杆菌基因组 DNA 为模板,利用简并PCR 技术扩增到基因(GT‐A )全长序列.该序列全长1287 bp 、编码423个氨基酸,分子量约为49.2 KD .经序列分析,该基因属于糖基转移酶基因.根据 GT‐A 基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达重组质粒GTA‐pet28a ,并在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功诱导出了一个约50 kD 的融合蛋白.纯化后测定其糖基转移酶活性,与37℃相比,80℃的反应温度其活性能提高3.4倍左右.研究结果表明,该酶是一种具有应用潜力的嗜高温糖基转移酶.     

HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在大肠杆菌中表达、纯化

在大肠杆菌中HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶获得表达并进行纯化.根据NS3与NS4A两者形成异源二聚体的结构要求,并参照文献,通过基因拼接的方法设计了单链NS3/4A丝氨酸蛋白酶的基因.合成相应引物,利用反转录PCR从HCV患者血液中扩增出该蛋白酶的编码基因,克隆入原核表达载体pRSET-A,将重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a转化BL211(DE3)大肠杆菌,并诱导表达与纯化.成功地构建了重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a;重组质粒转化的BL21工程菌经IPTG诱导表达后,表达产物经SDS-PAGE和western-h1ot证实为NS3/4A丝氨酸蛋白酶,并用镍离子亲和层析方法获得纯化蛋白酶.获得的纯化NS3/4A丝氨酸蛋白酶为建立其酶活性测定系统奠定了基础.     

一种嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶基因在大肠杆菌中的诱导表达与活性表征

从嗜酸普鲁兰芽孢杆菌基因组中扩增出普鲁兰酶基因Pul A,并将该基因连接到大肠杆菌表达载体p ET-28a中,构建了普鲁兰酶基因的诱导表达载体p ET-28a-Pul A。测序结果表明,普鲁兰酶基因Pul A长度为2766 bp,编码922个氨基酸。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,普鲁兰酶基因Pul A在IPTG诱导下获得表达,产生胞内蛋白。SDS-PAGE测定的分子量约为110 k D。细胞超声破碎液酶活为0.45 U/m L。该酶的最适温度为55℃,最适p H为5.0,金属离子对酶活性影响不显著,具有I型普鲁兰酶特性。此重组普鲁兰酶的酶学性质表明此酶具有独特的耐酸性质,具备一定的工业化应用价值。     

米根霉L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

文章以米根霉基因组DNA为模板,根据已公布的米根酶L-乳酸脱氢酶基因(ldnL)序列设计引物,PCR扩增得到含有ldnL的DNA片段;PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldnL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldnL;pET17b-ldnL转化大肠杆菌BL21(DE3),摇瓶培养诱导表达后的菌体经SDS-PAGE电泳分析,结果表明克隆的ldnL基因在大肠杆菌中实现表达。     

毕赤酵母表达重组植酸酶酶学性质的比较研究

通过酶学性质比较毕赤酵母GS115表达的E.coli K12植酸酶(appA)及其突变体植酸酶(appA NR)和黑曲霉植酸酶(phyA)的最适pH、温度、热稳定性及对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性.结果表明,在95℃,加热10 min,appA NR可残余90％左右的活力,而其他两种只残余20％～50％的活力;appAN...     

植酸酶及其应用

在以植物性原料为主的畜禽配合饲料中,大部分磷以植酸磷的形式存在,畜禽因缺乏内源性的植酸酶而对其的利用率极低。本文对配合饲料中添加植酸酶进行了研究。     

植酸酶在水产养殖中的应用（综述）

从植酸酶对水产动物生长性能、磷及其它矿物质生物利用、水产动物饲料营养消化率、水产动物体成分、水产动物血液生化指标等的影响和降低磷酸二氢钙用量,减少环境污染方面综述了新型饲料添加剂植酸酶的作用。探讨了水产饵料中添加植酸酶的最适添加量问题和植酸酶的活性问题。从提高水产动物饲料利用率;减少环境污染,保护生态平衡等方面阐述了植酸酶在水产养殖中的应用前景。     

植酸酶在水产动物中作用机制及其应用研究

植酸酶是一种新型饲料添加剂，它能提高动物对饲料中植酸磷的利用率，降低粪便中磷的排泄量，因而开发和研究水产专用植酸酶具有重要的生产和环保意义。综述了植酸酶对水产动物的作用机制、研究现状，并对植酸酶在水产饲料中应用所面临的问题及前景进行分析。     

利用酶法生产肌醇初步研究

植酸酶能将植酸及其二价盐类菲丁水解生成磷脂酰肌醇,在磷酸酯酶的继续作用下,磷脂酰肌醇被分解为肌醇。无花果曲霉能同时分泌植酸酶和磷酸酯酶。通过对无花果曲霉（Ａ．ｆｉｃｕｕｍＡ．ｓ３．３２４）产生植酸酶和磷酸酯酶条件的研究,在确定的最佳条件下,植酸酶和磷酸酯酶活力分别达到５．７ｕ／ｍＬ、０．５３３ｕ／ｍＬ。用所得发酵液水解菲丁制备肌醇,使肌醇的转化率达１０．３％。     

植酸酶在肉鸡生产中的应用研究进展

植酸酶作为饲用酶制剂在养鸡生产中得到广泛应用。通过对国内外植酸酶研究状况的分析,从植酸酶对肉鸡生产性能、屠宰性状、日粮营养物质利用率、氮磷排泄、血液生化指标的影响方面进行了综述,以期科学合理地利用植酸酶,最大化地提高添加植酸酶的经济效益和社会效益。     

外源植酸酶对杂交水稻种子萌发的影响

以杂交水稻两优288为材料,用外源植酸酶处理种子,测定萌发后种子中α-淀粉酶活性、可溶性糖含量、植酸酶活性.结果表明,种子由休眠转入萌发状态的过程中,经过植酸酶处理后的种子较对照组,α-淀粉酶活性增强,可溶性糖含量剧增,新陈代谢活跃,但随着萌发时间的延续,α-淀粉酶活性减弱,可溶性糖含量有所降低,而外源植酸酶处理过的种子α-淀粉酶活性、可溶性糖含量以及内源植酸酶活性高峰期较对照的早,且持续时间长.说明植酸酶在杂交水稻种子萌发过程中起着重要作用.     

白酒糟综合利用研究

叙述了白酒糟综合利用的发展与现状,包括利用白酒糟提取复合氨基酸及微量元素、制取甘油、提取植酸和植酸钙镁(菲汀)、培养食用菌、酿醋和生产饲料技术。通过已报道技术的对比分析,可见在解决酒糟对环境污染的同时又取得较大的经济效益的最优技术是首先提取植酸和植酸钙镁(菲汀),然后再利用酒糟生产高蛋白多酶菌体饲料。     

微生物植酸酶对土壤有机磷组分含量及有效性的影响

为提高土壤有机磷素的有效性,并为微生物植酸酶应用于农业生产实践提供理论参考,采用室内培养的方法,研究了不同用量微生物植酸酶菌剂在不同培养时期对土壤有机磷组分含量及有效性的影响.结果表明,添加微生物植酸酶菌剂处理后的土壤活性、中等活性有机磷含量均高于对照,而且与植酸酶菌剂使用量显著相关;其含量随培养时间的延长呈增加趋势,培养至第32d后基本保持平稳;而土壤中稳性和高稳性有机磷含量均低于对照,与植酸酶菌剂使用量显著相关;其含量随培养时间的延长呈减少趋势,培养至第32d后基本保持平稳.添加微生物植酸酶各处理的有机磷总量均低于对照,并随微生物植酸酶添加量的增加而减小;而土壤有效磷含量均高于对照.因此微生物植酸酶可以促进土壤稳定性有机磷向活性有机磷转化,乃至向无机磷转化,从而提高了土壤有机磷素的有效性.