油葵种子特异性基因HaAP10启动子克隆及功能验证

为研究植物脂质转移蛋白基因HaAP10启动子能否在油葵种子中驱动外源基因特异性表达,从油葵(Helianthus annuus L.)基因组DNA中采用PCR技术克隆了HaAP10基因上游的调控序列964bp.序列分析结果表明,964bp核苷酸序列与报道序列同源性99%,包含TATA-box等基因表达的重要特征元件及种子特异表达所必需的核苷酸序列.将其与β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因融合构建植物表达载体,并利用花粉管通道法转化油葵获得转基因植株,通过PCR鉴定和组织化学染色进行分析.PCR扩增初步证明目的片段已整合到油葵基因组中,组织化学分析表明HaAP10基因启动子能够驱动GUS基因在种子中特异表达,而在根、茎和叶中无GUS活性.结果表明HaAP10基因上游964bp片段可驱动外源基因在油葵种子中特异性表达,具有种子特异性启动子的功能,为油葵植物生物反应器的构建提供了优良的基因资源,同时也为油葵的油脂基因工程改良提供了基因资源.     

水稻花粉特异性启动子的克隆与表达

利用PCR技术,从水稻幼苗总DNA中扩增并克隆了一段DNA片段。将该片段与报告基因GUS基因融合,构成植物表达载体。经农杆菌转化烟草萌发花粉,共培养约24h后,作瞬时表达检测。结果表明,该克隆片段具有启动子功能。DNA序列分析表明,该克隆片段长度为526bp,含有TATA盒及CAAT盒。与原基因（PSI）启动子序列比较,同源性为52％。部分顺式调控元件相同。     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5''端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白（KAP6-1）基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物，以绵羊基因组DNA为模板，PCR扩增出1042bp的特异性片段，连接到pMD19T载体中获得该片段克隆．经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段．DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5＇端调控区序列相比具有很高的一致性．研究结果为今后制备转基因克隆动物，在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础．     

水稻RSSG8基因启动子与GUS融合基因的构建及在烟草中的瞬间表达

使用染色体步移(Genome walking)法，从籼稻(Oryza sativa subsp．indica)桂朝2号基因组中克隆到长度为471bp的水稻精细胞优势表达基因RSSG8的启动子片段R8PN，并进行了全序列测定和分析．该段序列中含有3个CAAT-box，6个Gobox和多种植物顺式作用元件，但没有发现典型的TATA-box，推测为一种特殊的启动子结构，为了鉴定RSSG8基因的基本启动子元件，将二条长度不同的5’端侧翼区缺失体(分别长471bp，260bp)定向插入载体pBI121中，取代原有的CaMV 35S启动子，构了驱动报告基因GUS的植物表达载体pRGUS1，pRGUS2，通过农杆菌介导的瞬时表达法转化烟草叶片和花粉，快速鉴定启动子片段中起关键作用的区域，结果显示两个缺失片段都能启动GUS的表达，可以初步判定这两个片段具有启动子功能。     

杂交鹅掌楸LhARF2基因启动子的克隆及瞬时表达分析

生长素响应因子(Auxin response factor, ARF)参与调控植物生长发育的多个途径。本研究利用Tail-PCR技术从杂交鹅掌楸中克隆LhARF2基因5′端上游2 637 bp序列,即pLhARF2启动子,并利用生物信息学软件PlantCARE分析其包含的调控元件,发现其含有启动子必需元件TATA-box和CAAT-box,以及压力响应、激素响应、光信号转导和代谢循环过程元件。构建pLhARF2-pCAMBIA1300:GUS植物表达载体并瞬时浸染本氏烟草叶片,利用GUS组织化学染色法鉴定烟草叶片中瞬时表达活性,发现在烟草叶片中有蓝色斑块,但颜色较浅。实验结果推测杂交鹅掌楸pLhARF2启动子可以调控GUS基因活性,为下一步研究启动子遗传转化的组织表达活性奠定了基础。     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5′端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP 6-1)基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增出1 042 bp的特异性片段,连接到pM D 19T载体中获得该片段克隆.经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段.DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5′端调控区序列相比具有很高的一致性.研究结果为今后制备转基因克隆动物,在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础.     

水稻硝酸还原酶基因5′上游序列的克隆与序列分析

以日本晴水稻幼苗叶的基因组总DNA为模板,采用PCR方法扩增获得约1 300 bp大小的DNA片段,回收该片段并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌感受态,并提取质粒DNA.用凝胶电泳检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析.测序结果显示,该片段含1 376个核苷酸对;应用NCBI网站的BLAST软件对本试验中克隆的序列与GenBank(NC_008401)公布的水稻硝酸还原酶基因启动子序列进行比对,有3个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻硝酸诱导基因启动子.该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA-box、CAAT-box和GAGA-box).此序列的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础.     

绵羊β-乳球蛋白基因调控序列的分离、克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｈＰ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间．ＰＣＲ产物的克隆经双酶切、ＰＣＲ检测和序列分析证明是绵羊β－乳球蛋白基因的调控序列．序列分析结果表明该克隆片段与绵羊β－乳球蛋白基因相应ＤＮＡ序列相比有很高的一致性．研究结果为指导异源基因的表达和进一步利用乳腺特异表达的转基因动物生产医用蛋白提供了有效的调控序列．     

八肋游仆虫一个新β-微管蛋白基因的克隆与序列分析

从八肋游仆虫细胞中克隆到一种新的β-微管蛋白基因.序列分析结果表明:在大核中,该基因全长1561bp.与已经报道过的β-微管蛋白基因不同,它的5′端基因上游调控序列有49 bp,AT含量为75.5%.上游调控序列中仅有一个TATAA框,没有CCAAT框;该基因的3′端的下游调控序列有121 bp,富含AT碱基,达到86.8%,其中有明显的反向重复序列.上下游调控序列中各有一个断裂信号TTGAA和TTCAA,负责从小核到大核发育过程中大核染色体的形成.从小核基因组中克隆到相应的基因片段,比大核中的序列多7个碱基5′-CATGCTC-3′,其功能尚不清楚.序列比对表明,新的β-微管蛋白基因与已经报道的β-微管蛋白基因的同源性92.3%,阅读框中有2个氨基酸的变化,将它命名为β2-微管蛋白基因.     

水稻16kDa醇溶蛋白启动子克隆及载体构建

水稻种子16 kDa醇溶蛋白是水稻种子成熟过程中,由16 kDa基因编码,16 kDa醇溶蛋白启动子调控,在胚乳中特异表达的蛋白质.以水稻基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到16 kDa启动子片段,序列分析结果表明:获得的启动子片段的大小为931 bp,与已报道的该启动子序列相比较,其核苷酸序列同源性为99.9%.该启动子区域含有TATA-box,CAAT-box,GCN4基序,Prolamin-box等胚乳特异表达启动子所必需的正调控元件.利用该启动子构建了植物种子特异表达载体pC16 kDP.     

毛白杨4CL基因启动子的克隆及初步功能分析

4CL(4-coumarate:CoA ligase,4-香豆酸:辅酶A连接酶)在植物木质素合成途径中催化羟基香豆酸生成羟基肉桂酰CoA,主要在木质部中表达,对植物木质素生物合成具重要调控作用.为研究4CL基因启动子在转基因植物中的表达特性,探索其在植物基因工程研究中的潜在应用价值,利用PCR方法从毛白杨基因组DNA中扩增得到了4CL启动子片段.序列分析表明与美洲山杨(P.tremuloids)的4CL启动子同源性为95%.采用生物信息学方法对该序列进行分析.与GUS基因融合构建双元表达载体,转化烟草的瞬时表达检测可见明显GUS活性.     

杨树木质部特异性定位表达4CL1启动子的结构与表达特性

4-香豆素COA连接酶(4CL1)是木质素代谢途径中的一个关键酶,对该基因启动子的表达特性与调控元件进行了研究:首先,对毛白杨4CL1启动子进行了生物信息学分析,结果表明该启动子包括3个顺式作用元件,box P(CCTTCACCAACCCCC),box A(CCGTTC),box L(TCTCACCAACC),这3个顺式作用元件在已知的木质素代谢途径相关酶系如苯丙氨合成酶(PAI)和4CL中普遍存在;其次,运用PCR方法对该启动子进行了剪切,获得一个长393 bp的启动子片断,该启动子片断包括以上3个顺式作用元件;最后,将该启动子片段与GUS报告基因构建了植物表达载体并转化烟草,成功获得转基因再生苗,结果发现转基因烟草的茎木质部呈现GUS染色阳性.研究结果表明,一个393 bp长度的4CL1启动子片断足以介导外源基因在木质部特异性定位表达.     

短柄五加(Acanthopanax brachypus)rbcL基因的结构分析

克隆了含完整短柄五加rbcL基因的3.2kb EcoRI片段,测定了该基因的核苷酸序列.所测核苷酸序列总长度为1924bp,其中编码区1428bp,编码475个氨基酸的蛋白质.测定的基因5’上游区共278bp,包含原核性质-35区(TTGCGC),-10区(TACAAT)及类似真核的TATA box元件(TATATA).5’前导区长194bp,其中SD序列为GGAGG,紧邻起始密码子上游.测定的3’下游区共218bp,含2个相邻的转录后可形成茎环结构的反向重复序列.短柄五加rbcL基因编码区推导的氨基酸序列与烟草、菠菜、豌豆、苜蓿、玉米、水稻、松树、地钱、衣藻和Anacystis的同源性分别为93.5％、94.11％、94.53％、94.74％、89.68％、92.21％、92.21％、92.63％、87.58％和80.84％.本文还对不同植物rbcL基因的启动区及部分5’和3’非编码区进行了比较分析.     

甘蓝型油菜Toc33基因启动子的克隆及序列分析

叶绿体是植物细胞中重要的细胞器，大部分叶绿体蛋白质都是由核基因组编码，在细胞质中合成分子量较大的前体蛋白，转运至叶绿体实施其功能．TOC33／TOC34是叶绿体上发现的一个外膜蛋白转运器构件蛋白，它与TOC159、TOC75和TOC64相互作用，构成了叶绿体外被膜上的一个蛋白转运器．目前已从豌豆（Pisumsa tizrurn）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、小立碗藓（Physcomitrella patens）、诸葛菜（Orychophragmus violaceus）和油菜（Brassica napus）克隆到TOC33或TOC34的cDNA或DNA的编码区．与其功能研究相比，Toc33基因的表达调控研究较少，该基因5’端调控区域的克隆及序列分析均未见报道．为此，在本实验室已经克隆到甘蓝型油菜Toc33基因编码区的基础上，采用单引物PCR方法进行染色体步移，克隆出Toc33基因的启动子，为进一步研究Toc33基因的转录调控机制奠定基础．     

拟南芥VHA-c3基因的特异性表达和调节

利用RT-PCR技术检测VHA-c基因在拟南芥中的表达,结果表明VHA-c3基因在拟南芥的果荚、花、叶、茎和根中都有表达,但是,在叶中的表达量远远高于其它的组织.以GUS基因作为报告基因构建了不同长度的VHA-c3基因启动子缺失突变体,利用农杆菌介导的瞬时表达系统检测GUS基因的表达,研究发现在VHA-c3基因起始密码子上游2812-2 234 bp之间的区域內存在着控制VHA-c3基因高表达的转录调控元件.     

SCFP,a novel fiber-specific promoter in cotton

To investigate the expression pattern of GhSCFP which was isolated from cotton fiber cDNA library, a 1006 bp upstream fragment of the gene was cloned by chromosome walking and fused to GUSand GFP respectively. Histochemical GUS and GFP fluorescence analysis revealed that the expression of the report genes driven by the promoter sequence was detectable only in outer layer cells during the seed development in the transgentic tobaccos. In transgenic cotton, strong GUS activity was observed in spherical protrusions on 0 dpa （days post anthesis） ovule surface, and in the 2-36 dpa fiber cells, while no GUS signals were detected in the root, leaves, stem, corolla, anther and stigma. Our data demonstrated that GhSCFP upstream sequence is a cotton fiber-specific promoter and this promoter will be useful in the molecular research on fiber cell development and in cotton fiber improvements by genetic modification.     

烟草NFL1基因启动子区的克隆和初步的功能分析

植物的开花过程是一个复杂的发育过程,涉及到许多基因的表达和调控,其中LFY同源基因(LFY-like genes)发挥着重要的作用[1～7].在拟南芥中,LFY基因发生突变而失去功能后,花芽分生组织的形成受到显著的抑制[8];将LFY基因在植株中的表达水平提高后则可以有效地促进开花[9].     

Activity of the truncated promoter of pollen-specific G9 gene of cotton and the transgenic recessive nuclei-sterile tobacco

A 557 bp fragment from the translation initiation site of the G9 gene expressed in maturing pollens of cotton was isolated from genomic DNA of upland cotton (Gossypium hirsutum L.) cv. “Zhongkang 17”, and two expression vectors for plant transformation were constructed via fusing this fragment with β-glucuronidase gene (Gus) and cytotoxin gene Barnase. The promoter activity of this fragment was demonstrated via transient expression of Gus gene in cotton and by the integrated expression of Barnase gene in tobacco. This promoter can initiate the expression of exogenous gene specifically and efficiently in plant pollen. The transgenic tobacco plant containing G9-Barnase fusion gene showed the characteristics of recessive nuclei-sterility.     

苦瓜McAG2启动子的克隆与表达研究

文中从苦瓜基因组中克隆得到长为1417 bp的McAG2基因5′上游片段并进行了DNA序列分析.通过PCR得到了其缺失片段,将其插入pBI121载体替换CaMV35S启动子,得到了McAG2基因5′侧翼缺失表达载体.并利用农杆菌介导转化烟草,建立了相应的转基因烟草植株,以研究其在不同器官组织中的表达特性. β-glucuronidase(GUS)染色结果显示该启动子在转基因烟草叶片和根组织中没有表达活性.