核酶转基因载体的构建及在烟草原生质体中对TMV感染的抑制作用

设计切割烟草花叶病毒RNA的锤头型核酸Rz－2，分别以pKyLx7和pBin19为载体，构建含Rz－2基因及核酸和底物连接的RzSb－2基因的重组质粒，通过三亲交配将目的基因转入土壤农杆菌中的Ti质粒．重组Ti质粒通过PEG法转化烟草原生质体，同时对转化的原生质体接种TMVc一定时间后以半叶法检测原生质体中病毒的侵染性．结果表明转基因原生质体中TMV侵染性明显低于未转基因的对照，推测病毒在转基因的原生质体中复制受到干扰；且核酸Rz－2（正向）表达后作用最为明显，核酸连底物RzSb－2（正向）与RzSb～2（反向）之间有明显差别．     

合成U3snRNA基因上游启动区构建ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因的植物表达载体

利用反义 RNA和核酶进行基因表达调控是当今植物分子生物学的研究热点之一 .但在转基因植物中 ,利用 RNA聚合酶 型启动区表达效率不高 .番茄 U3sn RNA基因由 RNA聚合酶 来转录 ,具有较高的转录效率 ,为一般转录效率的 1 0 0～ 1 0 0 0倍 .我们人工合成了番茄 U3sn RNA基因上游启动区 ( 1 5 2 bp) ,构建到番茄 ACC合成酶的反义 RNA-核酶嵌合 DNA序列的上游 ,然后将“启动区 -反义 RNA-核酶嵌合 DNA序列”插入到植物双元表达载体p GA6 4 3中 ,并用三亲融合法导入农杆菌 LBA4 40 4中 ,为研究 U 3sn RNA上游启动区增强反义 RNA-核酶基因的表达奠定了基础     

利用番茄U3snRNA基因上游启动区构建植物表达载体及对烟草的转化

利用番茄U3snRNA基因上游启动区和ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因DNA片段,构建含U3snRNA基因上游启动区-ACC合成酶的反义RNA-核酶嵌合序列的表达载体,重组于植物双元表达载体pGA643中,得到pGU3R.用三亲融合法导入农杆菌LBA4404中,采用叶盘法转化烟草,诱导再生小植株,获得了卡那霉素的抗性植株.提取抗性植株总DNA,通过PCR、PCRSouthern杂交检测并分别用启动区序列和ACC合成酶的反义RNA-核酶嵌合序列作探针,通过Southern杂交检测,已筛选出整合有外源基因的转化植株.为进一步研究U3snRNA上游启动区增强反义RNA-核酶基因的表达奠定了基础.     

人端粒酶催化亚单位(hTERT)特异性核酶对乳腺癌细胞MCF-7活性的作用及影响

目的 探讨端粒酶特异性核酶对乳腺癌细胞MCF-7端粒酶活性、增殖和凋亡的影响.方法 设计合成RZ基因,构建人端粒酶锤头状核酶真核表达质粒pcDNA3.1( )-hTERT-RZ,测序鉴定.提取MCF-7细胞总RNA,RT-PCR扩增靶基因的cDNA片段,插入载体pMD18-T并测序鉴定.将核酶重组体及hTERT载体体外转录,琼脂糖凝胶电泳检测Rz的切割活性.核酶载体转染乳腺癌细胞MCF-7,RT-PCR法检测核酶重组子转染效率及核酶转染细胞中hTERT mRNA的表达量,TRAP法测定细胞端粒酶活性,MTT法、流式细胞仪测定细胞增殖及凋亡.结果 测序表明peDNA3.1( )-hTERT-Rz和pMD18-T-hTERT构建成功.5%琼脂糖凝胶电泳表明体外转录出Rz和靶基因hTERT,Rz对靶基因hTERT具有切割活性.构建好的核酶真核表达载体转染乳腺癌MCF-7细胞.发现其潜伏期延长,对数生长期减缓,S期细胞比例降低,G1期细胞比例增高(P＜0.01).端粒酶活性检测发现端粒酶活性明显降低.结论 端粒酶催化亚单位特异性核酶对靶基因hTERT在体外和体内均有催化切割活性,该核酶在乳腺癌MCF-7细胞中抑制hTERT的表达和细胞增殖,为核酶应用于恶性肿瘤的基因治疗提供了实验依据和新型工具酶.     

核酶转基因载体的构建及在烟草原生质体中对TMV感染的抑制 …

设计切割烟草花叶病毒ＲＮＡ的锤头型核酶Ｒｚ－２，分别以ｐＫｙＬｘ７和ｐＢｉｎ１９为载体，构建含Ｒｚ－２基因及核酶和底物连接的ＲｚＳｂ－２基因的重组质粒，通过三亲交配将目的基因转入土壤农杆菌中的Ｔｉ质粒。     

烟株不同叶位及接种方式对TMV传播的影响

为进一步弄清烟草普通花叶病毒病的传毒规律.试验以烟草品种K326为材料,连续3a以不同接种方式对健康烟株进行TMV接种试验.结果表明:烟草普通花叶病不通过烟叶气孔传毒,而是通过微伤口、大伤口和叶面与叶面接触渠道传播病毒,而且病毒人口离生长中心越近,病毒传播表现的速度更快,病毒的潜伏期为15～30 d,且在接种30～45d内,烟叶的发病率有一高峰值;烟草普通花叶病毒在烟株的幼嫩叶片上更易传播,症状表现在接种以上的叶片上,带病症的老叶片随着烟株的生长,症状会慢慢消失;在20～35℃的范围内,高温高湿有利于病毒的侵染和症状的表现.杜绝烟草幼嫩叶片摩擦伤口和TMV接触,是防治烟株上TMV传播的有效途径.     

核酶的化学合成及其对烟草花叶病毒RNA片段的体外剪切

设计并用化学方法合成了针对烟草花叶病毒ＲＮＡ的核酶ＲＺ－１及ＲＺ－１小型化的核酶ＲＺ－２以及它们的底物ＲＮＡ片段Ｓｂ,研究了两种核酶对底物Ｓｂ的体外催化活性,并把核酶Ｒｚ－１与生物合成的相同组成的核酶Ｒｚ－１’进行了比较试验。     

杨树木质部特异性定位表达4CL1启动子的结构与表达特性

4-香豆素COA连接酶(4CL1)是木质素代谢途径中的一个关键酶,对该基因启动子的表达特性与调控元件进行了研究:首先,对毛白杨4CL1启动子进行了生物信息学分析,结果表明该启动子包括3个顺式作用元件,box P(CCTTCACCAACCCCC),box A(CCGTTC),box L(TCTCACCAACC),这3个顺式作用元件在已知的木质素代谢途径相关酶系如苯丙氨合成酶(PAI)和4CL中普遍存在;其次,运用PCR方法对该启动子进行了剪切,获得一个长393 bp的启动子片断,该启动子片断包括以上3个顺式作用元件;最后,将该启动子片段与GUS报告基因构建了植物表达载体并转化烟草,成功获得转基因再生苗,结果发现转基因烟草的茎木质部呈现GUS染色阳性.研究结果表明,一个393 bp长度的4CL1启动子片断足以介导外源基因在木质部特异性定位表达.     

pap和ipt共表达与提高转基因烟草抗病性的初步研究

通过构建pap与ipt共表达的双元载体,利用农杆菌介导,将pap与ipt共表达基因导入烟草K326品种的叶肉细胞,经过抗性筛选和鉴定,获得高表达的转基因植株,并对其进行了攻毒实验.结果表明:pap与ipt共表达基因转化烟草的转化率明显提高(25%),证实转基因细胞中ipt基因表达可降低PAP细胞毒性;接种烟草花叶病毒(TMV)后,pap高表达的转基因植株出现病症的时间延迟20 d,叶片失绿程度较轻,表明该转基因植株对病毒的抗性有一定程度的提高.     

AtGT-3b基因克隆及原核表达与纯化

GT-3b转录因子是一个受NaCl和病原体诱导表达的GT-1-like转录因子,它能与GT-1 cis-element( GAAAAA)相互作用,促进下游基因的表达,在植物耐盐中起着重要的调节作用.通过分离了拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGT-3b基因,克隆到原核表达载体pCold TF中,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中进行融合表达;通过纯化得到AtGT-3b融合蛋白,以期用于研究其与GT-1顺式作用元件在体外的相互作用.     

10个不同种类与等级的蜂蜜样品热裂解及其产物的比较分析

 组合应用热裂解、冷进样系统和气质联用仪(Py-CIS-GC/MS)对10个不同种类及等级的蜂蜜样品的有氧裂解行为进行了研究.在氧氮混合气体氛围(氧气和氮气按体积比9∶91混合)下,对10个蜂蜜样品在不同裂解温度(900,600,300℃)下的裂解产物挥发性成分进行分析比较,结果表明:①蜂蜜样品在900,600,300℃3个裂解温度下裂解,其共有裂解产物及半数以上样品共有裂解产物个数分别为:900℃,7个和20个,600℃,7个和16个,300℃,4个和6个;3个温度下均裂解出了糠醛、2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、5-(羟甲基)-2-呋喃甲醛、D-阿洛糖4种产物;随着温度的降低,裂解产物个数、质量分减少,但各个温度下各蜂蜜样品主要裂解产物及其在产物中的质量分数差别不大;②3个温度下的裂解产物都以醛类、酮类、糖类以及呋喃、吡喃类物质为主;③部分蜂蜜挥发性成分原形转移进入裂解产物;④冷进样系统对热裂解产物的在线捕集更为完全.     

流动注射-冷蒸汽发生AAS法测定烟草样品中的痕量汞

 研究了以KBH₄为还原剂的流动注射-冷蒸汽发生原子吸收光谱法,测定烟草中痕量汞.就其分析条件对灵敏度影响进行了优化研究.本方法共存离子干扰小,精密度较高(平行测定10ng/mL的标准样品7次的相对标准偏差为2.80%)、检测限好(0.4ng/mL),线性范围在0.4～60ng/mL之间.利用HNO₃-H₂O₂体系微波消解进行了样品前处理,有较高的样品回收率(98.15%).测定结果令人满意.     

烟仓麦蛾茧蜂HABROBRACON HEBETOR(SAY)的生物学生态学特性研究

本文对烟仓麦蛾茧蜂的生物学和生态学特性进行了研究。结果表明,麦蛾茧蜂在烟仓的消长有2个高峰期,第1个高峰期发生在4月份,第2个高峰期发生在10月份。温度(T)对麦蛾茧蜂的寄生率(P)、卵孵化率(H)、成蜂的产卵量(L)和茧的羽化率(C)影响显著,其关系式可分别表达为:P=—352.67+32.54T—0.61T~2、H=—381.82+35.79T—0.67T~2、L=—82.05+16.32T+0.27T~2、C=—119.18+16.52T—0.32T~2。在不同的营养中,5％蜂蜜水对麦蛾茧蜂的影响最为显著。在同一温度下,麦蛾茧蜂成蜂的发育历期最长,其次是蛹,幼虫的历期高于卵的历期;对于同一虫态,随着温度的升高,其发育历期逐渐缩短。麦蛾茧蜂成蜂的发育起点最低,但其所需的有效积温最高;幼虫的发育起点温度最高;卵的有效积温最低。     

高效液相色谱法测定烟草中的淀粉含量

研究了用高效液相色谱法测定烟草中的淀粉含量，方法检测限为3．0mg／L，相对标准偏差为1．6-2．1％，标准回收率在95～105％之间。新方法用于几种烟草样品中淀粉含量测定，结果令人满意。     

Atomic force microscopic view of the fine topography on the tobacco stigma surface during its response to pollination

During compatible pollination in tobacco, an extracellular matrix （ECM） is secreted from the stigma surface; however, it is unknown whether the pattern of secretion across the stigma depends on the pollen source. In fact, technical limitations have prevented clear observation of ECM secretion. Here, we report the detailed topographic changes on the stigma surface that accompanies intraspecies and interspecies pollination in tobacco using contact mode atomic force microscopy （AFM）. Our results, which show the dynamics and time course of ECM secretion after pollination, indicate that a certain pattern of secretion already exists on the stigma prior to pollination. Intraspecies induced a two-step response, characterized by topographical changes on the stigma surface several hours after pollination, which was distinct from the pattern of ECM secretion induced by interspecies pollination. This difference was confirmed by root-mean-square analysis, which assessed the roughness of the stigma surface. Our findings indicate that compatible pollination not only induces ECM secretion from the stigma, but also results in a specific distribution of the ECM. Thus, this study demonstrates the powerful potential of AFM in studying the pollen-stigma interaction.     

苜蓿花叶病毒RNA_23′端cDNA转基因烟草的研究

将克隆的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV-Ch)RNA23′端cDNA重组到植物表达载体pROKII中,用三亲融合法导入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404,采用叶圆片法转化普通烟草,诱导再生小植株.经卡那霉素抗性筛选和PCR检测,证明AlMVRNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中.     

球孢白僵菌对烟蚜致病力研究

通过球孢白僵菌兑成孢子悬浊液感染烟蚜的方法检测球孢白僵菌对烟蚜的致病力和防治效果.室内试验时所供测试的七个菌株均对烟蚜具有毒性,其中菌株C j4、Ly4、Sc145的感染致死力均达到100%,菌株Sc145在第6 d感染率就达到100%,表现最为突出;室外试验在第6 d时所有菌株对烟蚜的防治效果都大于85%,最高为菌株Sc145、C j4,达到93.4%和93.3%.从中有球孢白僵菌对烟蚜有较强的感染致死力,其中测试菌株Sc145、C j4室内感染致死力和室外防治烟蚜效果最好.     

烟草中多种元素的ICP-AES分析

介绍了ＩＣＰ－ＡＥＳ法在烟草多元素分析中的应用研究,此方法用微波消解（硝酸－Ｈ２Ｏ２密闭体系）烟草样,ＩＣＰ－ＡＥＳ法测定烟草中多种元素,测定结果的相对标准偏差为０．４６％－６．４７％,标准回收率为９２．２０％－１０６．５０％。     

烟田黑带食蚜蝇幼虫的空间分布型研究

对烟田黑带食蚜蝇幼虫的空间分布型测定结果表明:聚集度指标测定为聚集分布;频次分布检验为负二项分布;Iwao的m~*—m的回归模型为m~*=—0.2489+2.3886m,说明属于具有公共K值的负二项分布。分析了田间抽样的理论抽样数。