合成U3snRNA基因上游启动区构建ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因的植物表达载体

利用反义 RNA和核酶进行基因表达调控是当今植物分子生物学的研究热点之一 .但在转基因植物中 ,利用 RNA聚合酶 型启动区表达效率不高 .番茄 U3sn RNA基因由 RNA聚合酶 来转录 ,具有较高的转录效率 ,为一般转录效率的 1 0 0～ 1 0 0 0倍 .我们人工合成了番茄 U3sn RNA基因上游启动区 ( 1 5 2 bp) ,构建到番茄 ACC合成酶的反义 RNA-核酶嵌合 DNA序列的上游 ,然后将“启动区 -反义 RNA-核酶嵌合 DNA序列”插入到植物双元表达载体p GA6 4 3中 ,并用三亲融合法导入农杆菌 LBA4 40 4中 ,为研究 U 3sn RNA上游启动区增强反义 RNA-核酶基因的表达奠定了基础     

番茄ACC合成酶基因的反义RNA—核酶嵌合基因植物表达载体的构建及对番茄的转

将克隆的番茄ACC合成酶基因的反义RNA－核酶联合的DNA序列用Hind Ⅲt KpnI切割后重组于植物表达载体pGA643中,用三亲融全导入农杆菌LBA4404中,采用叶盘法转化茄子叶,诱导出再生小植株,获得了卡那霉素的抗性植株。提取植物总DNA,用pGA643作探针,通过斑点杂交,已筛选出整合有外源基因的工程植株。为进一步研究该嵌合基因对ACC合成酶基因表达的影响及获得商品化的转基因番茄奠定了基础。     

苜蓿花叶病毒RNA_23′端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1/2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV-Ch)RNA23′端cDNA,重组到植物表达载体pROKII中,通过致瘤农杆菌(A-grobacteriumtumefaciens)介导,以叶圆片为转化材料,转化普通烟草,并获得了转基因植株.经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明AlMVRNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中.转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性.     

甘蓝型油菜3个AP3重复基因植物反义表达载体的构建及遗传转化

利用pFGC5941构建了甘蓝型油菜3个AP3重复基因的植物反义表达载体pFGC5941-BnAP3-2、pFGC5941-BnAP3-3和 pFGC5941-BnAP3-4.采用快速冻融法,将载体导入农杆菌EHA105,转化甘蓝型油菜下胚轴.在5mg/L PPT的MS培养基中筛选,获得反义BnAP3-2基因的抗性再生植株31株,反义BnAP3-3基因的抗性再生植株20株,反义BnAP3-4基因的抗性再生植株42株.PCR鉴定结果显示,获得BnAP3-2反义的基因植株12株,BnAP3-3反义的转基因植     

利用人内皮抑素基因构建植物表达载体及对烟草的遗传转化

将人内皮抑素(endostatin)基因重组于植物双元表达载体pGA 643,得到重组质粒pGE.用三亲融合法将其导入农杆菌LBA 4404中,采用叶盘法转化烟草,经诱导与筛选,获得了卡那霉素抗性植株.提取抗性植株总DNA,通过PCR扩增和Sou thern杂交检测,筛选出了整合有外源基因的转化植株.为进一步研究人内皮抑素在烟草中的表达及生物学功能奠定了基础.     

苜蓿花叶病毒RNA2 3''''端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1／2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AIMV-Ch)RNA：3′端cDNA，重组到植物表达载体pROKⅡ中，通过致瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导，以叶圆片为转化材料，转化普通烟草，并获得了转基因植株．经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明．AIMV RNA：3′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中．转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性．     

蜜瓜ACC氧化酶mRNA的成串锤头型核酶和反义RNA基因的合成和克隆

我们设计和合成了切割蜜瓜成熟果实ACC氧化酶mRNA的GUC^86、GUC^388、GUC^534的三重锤头型核酶（HhRz)和阻断转录的反义RNA（AR） 基因,并构建了二、四、八联体HhRz和AR基因。为了在体外和体内检测HhRz是否切割ACC氧化酶mRNA,在E.cloliDE3rna-菌株中克隆了同域和跨域作用的（HhRz)n-AR和靶子ACC氧化酶mRNA表达系统。又构建了植物体组成型和诱导型（HhRz)n-AR表达载体。     

分子生物学新技术—反义技术

反义技术是近年发展起来的一种分子生物学新技术。它根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列的反义核酸,从而抑制特定基因的表达,目前包括反义RNA、反义DNA和核酶三大技术。该技术的研究具有重要的理论意义和实际意义。     

马尾松银松素合酶基因转化双子叶植物表达载体的构建及鉴定

以马尾松为材料,在获得马尾松银松素合酶基因的基础上,构建了该基因转化双子叶植物的表达载体,该表达载体含有35S启动子和NOS终止子,能启动基因在双子叶植物中高效地表达.设计并合成分别含有Bgl和BstE酶切位点的上下游引物,通过PCR反应扩增出含有该酶切位点的银松素合酶基因cDNA全序列,酶切后连接到pCAMBIA1301植物表达载体上.经PCR鉴定、酶切分析及DNA测序证实cDNA片段大小、序列以及读码框的正确性.最后通过电击将表达载体转化农杆菌LBA4404,为进一步研究银松素合酶基因的功能奠定基础.     

针对马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆及体外转录

根据特异性切割马铃薯卷叶病毒中国分离株 ( PLRV-Ch)复制酶基因负链 RNA的锤头状核酶 ,设计、合成了编码与其相应的突变核酶的 c DNA,并克隆到质粒 p GEM-4 Z中 ,经序列分析及体外转录表明得到完整的突变核酶基因重组质粒 ,从而为突变核酶的转基因及进一步研究核酶在转基因马铃薯中表达引起的抗性及机理创造了条件     

甘草水通道蛋白PIP1基因正义和反义表达载体的构建

根据已报道的GuPIP1基因序列设计特异引物,克隆甘草水通道蛋白GuPIP1基因cDNA序列,将该片段正向、反向分别插入植物表达载体pMBW330的CaMV35S启动子和OCS终止子之间,构建了正义、反义表达载体．通过双酶切、PER和DNA测序鉴定后,分别导入农杆菌EHA105中．     

肝片吸虫抗原基因转基因苜蓿再生的研究

用直接转化法，将构建有肝片吸虫保护性抗原基因FH3的植物表达载体pBI121-FH3,导入感受态的根瘤农杆菌EHA105；以重组的根瘤农杆菌为介导，用叶盘法转化苜蓿外植体，筛选得到抗Kan转化外植体；抗性外植体通过诱导丛生芽和诱导生根，再生出完整植株，提出植株总DNA进行Southern blot，结果表明，FH3基因已经整合入苜蓿基因组中。     

Transgenic tobacco plants harboring tomato proteinase inhibitor II gene and their insect resistance

The plant expression vectors pBCT2 and pBT2 were constructed with the cDNA sequence (tin2) and genomic DNA sequence (tin2i) of tomato proteinase inhibitor II gene respectively. Then the two expression vectors were transferred into tobacco via the Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404, and transgenic tobacco plants were generated. Molecular analysis and trypsin activity assay showed that both cDNA and genomic DNA were expressed properly in the transgenic plants. Insecticidal activities in these transgenic plants indicated that transgenic tobacco plants carrying tin2i sequence were more resistant to 2-instar larvae of Heliothis armigera Hubner than those carrying tin2 sequence. Therefore the intron of tin2i sequence might be a contributor to insecticidal activity of the transgenic tobacco.     

大肠杆菌甜菜碱醛脱氢酶基因的测序及对烟草的转化

对利用聚合酶链式反应所克隆的大肠杆菌ｂｅｔＢ基因进行了序列测定,结果证实获得了该基因的克隆ｐＸＹ０１,ｐＸＹ０５以及亚克隆ｐＸＹ１１。将该基因置于ＣａＭＶ３５Ｓ启动子调控下,导入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４中,叶盘法转化烟草,在含卡那霉素的选择培养基上筛选抗性芽,并进一步诱导小植株的再生。利用ＰＣＲ技术检测基因整合到烟草基因组中。     

盐藻GPDH基因的载体构建及在烟草中的表达

作者用冻融法，将构建有盐藻3-磷酸甘油脱氢酶基因的植物高效表达载体DsGPDH导入感受态的根癌农杆茵EHA105中．叶盘法转化烟草，在含卡那霉素的MS培养基上进行选择性培养，生根率达到80％．用POR的方法对再生苗进行了初步筛选，阳性率约为50％．对PCR阳性苗，进行RT-PCR分析，证实整合到烟草基因组中的GPDH基因表达产生了mRNA．     

农杆菌介导的白芥防御素基因对甘蓝型油菜的转化

通过根癌农杆菌介导将正向和反向插入白芥防御素基因的pBI121重组质粒转入甘蓝型油菜的下胚轴，经组织培养和抗性筛选获得再生植株. PCR检测后，初步鉴定为阳性植株.     

根癌农杆菌电击转化条件的研究

探索了根癌农杆菌EHA105的高效转化方法.将双元载体质粒pBIN19/glgB经电击转化法导入根癌农杆菌EHA105,研究不同实验条件对转化率的影响.结果表明:在细胞浓度OD600为1.0时进行电转化,转化率最高,达到每微克DNA1.12×105CFU;当电场强度为11 kv/cm,转化率最高,达到每微克DNA1.78×105CFU;在一定的细胞浓度范围内,电击转化率与细胞浓度密切相关,转化率随着细胞浓度的上升而上升;质粒大小能影响电击转化率,转化率随着质粒的增大而下降.应用该优化的电击转化条件将双元载体质粒pBIN19/glgB成功导入根癌农杆菌EHA105,构建了植物双元表达载体.     

Introduction of pokeweed antiviral protein cDNA into Brassica napus and acquisition of transsenic plants resistant to viruses

Using cotyledonary petioles as explants, the PAP cDNA controlled by wound-in- ducible promoter has been introduced into Brassica napus by coculture with Agrobacterium tumefaciens and laser microbeam puncture respectively. Regenerated plants resistant to gen-tamycin have been selected out. PCR amplification and Southern blotting analysis indicated that PAP cDNA together with wound-inducible promoter had been integrated into Brassica genome with transformation frequencies of 2.0% and 1.7% for two transformation methods respectively. The test of virus challenge showed that these transgenic Brassica plants were resistant in different degrees to mechanically inoculated TuMV.