酿酒酵母中少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶对α-亚麻酸催化活性的研究

多不饱和脂肪酸(po lyunsaturated fatty ac ids,PU FA s)可分为n-6和n-3两个系列,而Δ6-脂肪酸脱氢酶是这些PU FA s合成途径中的限速酶.将少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因转化酿酒酵母营养缺陷型菌株INV S-cl,在添加外源性底物α-亚麻酸,经半乳糖诱导后,通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-M S)联用分析细胞脂肪酸表明,少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,所生成十八碳四烯酸的含量占酵母细胞总脂肪酸的7.67%,而在空载体pYES2.0转化的酵母中没有检测到.同时,参照K ozak序列,我们把少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列进行适当的改变,并转化INV Scl进行分析,结果显示修改后的序列同样能催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,而且表达量提高到细胞总脂肪酸的11.23%,表明在酿酒酵母中,改变转移起始密码子周边序列可提高少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因催化α-亚麻酸转合成十八碳四烯酸的水平.     

少根根霉△12-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

为探讨采用转基因的方法将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸菌株的可行性,将来自于丝状真菌少根根霉的△12-脂肪酸脱氢酶基因与毕赤酵母的胞内表达载体pPIC3.5K连接构建了重组表达载体pPICRAD12,经Sac I线性化后电击转化毕赤酵母菌株GS115获得转基因酵母菌株PICRAD12.PCR鉴定结果表明,目的基因已经整合到毕赤酵母基因组中.经甲醇诱导表达后,通过气相色谱和气相色谱和质谱连用的方法分析转基因毕赤酵母的脂肪酸成分表明,转基因毕赤酵母的亚油酸含量增加了4.5%,说明了可以通过增加△12-脂肪酸脱氢酶基因的拷贝数或者使用强启动子的方法来增加亚油酸的含量,为将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸的基因工程菌株进行了有意义的探索.     

毕赤酵母△~9-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌Δ9-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行PCR,获得一个741 bp的毕赤酵母cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端扩增技术(RACE)获得该cDNA的3′和5′序列,从而得到全长为1 689 bp的cDNA序列.序列分析结果表明,该序列具有一个长度为1 194 b p、编码397个氨基酸的开放阅读框(PPD9).与报道的Δ9-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和疏水结构,在其氨基酸序列的C-末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区.该序列为一个新的编码Δ9-脂肪酸脱氢酶的基因,为了验证其功能,把开放阅读框序列PPD9亚克隆到表达载体pYES 2.0,构建重组表达载体pYPPD9,并转化到酿酒酵母的Δ9-脂肪酸脱氢酶缺陷型菌株DTY-11A中进行表达。通过平板互补实验结果表明,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的蛋白具有Δ9-脂肪酸脱氢酶活性,能弥补DTY-11A中由于Δ9-脂肪酸脱氢酶的缺失而引起的致死性突变。     

人骨形态发生蛋白6(hBMP6)在毕赤酵母中的分泌表达

以重组质粒pcDNA6A-BMP6为模板PCR扩增hBMP6成熟肽cDNA编码序列,将该序列克隆到酵母分泌表达表达载体pPIC9K中.重组质粒pPIC9K-hBMP6经SacI酶切线性化,电击转化毕赤酵母GS115,PCR法筛选阳性转化子,利用梯度浓度G418筛选到七株高拷贝整合的阳性转化子。用甲醇进行诱导表达,SDSPAGE及Western-blot检测结果表明hBMP6成熟肽以分子量约为34和18 kD两种不同糖基化修饰的单体形式存在,具有良好的免疫原性.     

野生革耳菌漆酶cDNA在巴斯德毕赤酵母中的表达

将分离到的野生革耳菌(Panusrudis)漆酶的cDNA序列克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建成受强启动子AOX1控制的重组表达载体.重组质粒DNA经BglII线性化后,电击转化毕赤酵母GS115细胞,通过G418筛选和PCR鉴定的重组酵母在甲醇诱导后能分泌表达活性漆酶.低温培养是该漆酶基因活性表达的必要条件.培养基中添加400μmol/L的CuSO4最有利于漆酶的活性表达.     

重组人细胞色素P450 2C9在毕赤酵母中的胞内表达

以含有CYP2C9基因完全编码框的克隆载体质粒DNA为模板,并在人细胞色素P4502C9的5’端插入kozak序列及3’端6×His标签进行PCR扩增,克隆至真核表达载体pPIC3.5K,利用电激法将经Sal I线性化的重组质粒pPIC3.5K-2C9转化至毕赤酵母GS115中,通过抗性、表型和PCR筛选多拷贝整合株,甲醇诱导毕赤酵母GS115/pPIC3.5K-2C9的表达,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物.结果表明:含有重组质粒的重组pPIC3.5K-2C9表达了大小为55KD的目的蛋白,与预期大小相符,说明人细胞色素CYP2C9可在毕赤酵母的胞内表达.     

红冬孢酵母Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成的关键酶.参考已知的Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因序列设计特异性引物,通过PCR扩增从红冬孢酵母YM25235中获得了全长为1 341 bp的一个cDNA序列.序列分析表明,该序列具有一个编码446个氨基酸、相对分子质量为50.6 ku的完整开放阅读框,所编码的氨基酸序列与Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶相似性最高但并不相同,而且也具有Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区,表明该序列为一个新的编码Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶的基因.为了验证功能,将该基因序列克隆到表达载体pYES3/CT中,构建重组质粒pY3RKD12,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSCI中进行异源表达.通过脂肪酸气相色谱(GC)分析表明,在pY3RKD12转化的酵母细胞总脂肪酸中出现一个保留时间和亚油酸甲酯标准品相同的新峰,其含量占酵母总脂肪酸的3.76%,但在pYES3/CT转化的酵母细胞总脂肪酸中没有检测到.这些结果证明所克隆的序列是一个新的Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因,其表达的蛋白质可催化油酸合成亚油酸.     

链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶（MTG）在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构成重组质粒,然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,经测序证明为目的基因片段.结果表明：经过PCR和酶切均证明已经将目的片段转到酵母表达载体pPIC3.5k内.     

β葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用PCR的方法,以Bacillus macerans总DNA为模板,构建出β-1,3-1,4葡聚糖酶杂合基因bglHAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,得到重组质粒pPIC9K-HAM,电脉冲转化法转化酵母菌GS115,KM71,在MM,MD平板上筛选表型,YPD-G418平板上筛选多拷贝重组子,重组菌株经甲醇诱导后,刚果红平板染色法检测到β-葡聚糖酶活性,SDS-PAGE证明表达产物的分子量约为24kD,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株,胞外每mL发酵液最高酶活达240U。     

胞内表达猪生长激素基因的重组酵母菌构建与鉴定

将猪生长激素(pGH)cDNA定向插入毕赤酵母胞内表达载体pPIC 3.5k质粒，重组构建了pPIC 3.5kpGH/GS115酵母表达系统, 其表达产物的SDSPAGE和Western blot结果表明, pGH蛋白在胞内获得正确表达，表达量达378 mg/L.     

谷氨酰胺转胺酶在毕赤酵母菌的初步表达

从重组菌株pPIC3.5k-MTG/DH5α提取重组质粒pPIC3.5k-MTG,经Sac I酶切线性化处理后纯化重组质粒电击转化到毕赤酵母菌中,用甲醇诱导表达,经SDS-PAGE鉴定重组质粒P.pastoris GS115成功表达出了TGase蛋白,并初步纯化获得了较纯的目的蛋白,其表观分子量为47 kD,酶活为0.50 U/mL.     

超滤质谱法研究大黄蒽醌类化合物与 人血清白蛋白的相互作用

从重组菌株pPIC3.5 k-MTG/DH5α提取重组质粒pPIC3.5k-MTG,经SacⅠ酶切线性化处理后纯化重组质粒电击转化到毕赤酵母菌中,用甲醇诱导表达,经SDS-PAGE鉴定重组质粒P.pastoris GS115成功表达出了TGase蛋白,并初步纯化获得了较纯的目的蛋白,其表观分子量为47 kD,酶活为0.50 U/mL.     

匍枝根霉内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的克隆及表达

从匍枝根霉TP-02的cDNA文库中克隆得到其内切葡聚糖酶基因,并在毕赤酵母中进行表达.该内切葡聚糖酶基因大小为954bp,将其与pPIC9K质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,利用T4连接酶进行连接.将线性化后的重组质粒转化毕赤酵母GS115,并利用MD平板和刚果红平板进行筛选.阳性克隆经甲醇诱导培养84h后,产生的内切葡聚糖酶酶活力达到峰值为1.754IU/mL.     

深黄被孢霉Δ12-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建

 深黄被孢霉是国内研究生产γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA)和花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)等多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的主要产油丝状真菌.前期的实验结果表明,深黄被孢霉M6-22具有潮霉素抗性,而且目前也没有关于深黄被孢霉营养缺陷型菌株的报道,限制了一些基于深黄被孢霉菌株进行遗传操作的研究.研究以红色荧光蛋白DsRED基因作为报告基因,构建能同时用于丝状真菌外源基因和RNAi表达载体pS-DsRED.通过PEG/CaCl₂原生质体转化法将pS-DsRED导入深黄被孢霉M6-22中进行表达,成功获得产粉红色的阳性菌落,并在此基础上构建了深黄被孢霉Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达质粒pSREDMID12RNAi,为下一步目的基因的敲除和基因功能分析奠定了基础.     

扩展青霉FS1884脂肪酶基因的定点诱变及其活性分析

为提高扩展青霉FS1884脂肪酶活性,采用一步突变法对脂肪酶(PEL)的基因进行体外M220V定点诱变,然后将其连接到表达载体pPIC3.5K中, 构建重组表达载体pPIC3.5K-M220V-PEL,电转化毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导后脂肪酶成功分泌表达.重组脂肪酶的活性分析表明:突变体在毕赤酵母中得到活性表达,获得脂肪酶表达产物PEL-M220V-GS,在35 ℃下具有最高酶活为3 099 U/mg, 比野生型提高了5%.     

肺炎克雷伯氏菌漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)基因组为模板,通过PCR扩增得到其漆酶基因lac;基于毕赤酵母密码子偏爱性优化后,得到新型漆酶基因lacm;将其与大肠杆菌–毕赤酵母(E. coli-P. pastoris)穿梭表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-lacm;将该质粒转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115中,实现该漆酶的胞外分泌表达,发酵液中重组漆酶(rLACM)活力达0.37 U/m L.经对rLACM酶学性质分析表明:rLACM的最适温度为70℃,最适pH为8.0,在30～70℃、pH 5.0～9.0活力稳定.     

大鼠组织型金属蛋白酶抑制剂-1在毕赤酵母中的重组表达

提取SD大鼠肝组织总RNA,通过RT-PCR扩增TIMP-1 cDNA片段.将扩增产物克隆至pUCm-T载体上,PCR、限制性酶切及测序证实后,EcoRI和NotI双酶切pUCm-T-TIMP-1重组体,回收TIMP-1,再将其亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,并将阳性克隆进行PCR、酶切和测序分析,构建pPIC9K-TIMP-1表达载体,电击转化到毕赤酵母,通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌,为进一步研究TIMP-1功能和作用机理等的研究创造了条件.     

RGD-拖丝蛋白基因的构建及其在毕赤酵母中的分泌表达

根据天然拖丝蛋白的高度重复性序列,引入与细胞黏附有关的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列,以毕赤酵母偏好的密码子化学合成RGD-拖丝蛋白基因单体,通过"头尾相连"的多聚化策略,倍加成16聚体与32聚体基因.分别将这两种多聚体与分泌型表达载体pPIC9K连接,转化毕赤酵母GS115,用G418筛选毕赤酵母重组菌.通过甲醇诱导表达,培养液上清的SDS-PAGE分析表明RGD-重组拖丝蛋白获得分泌型表达.     

表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建

将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒pPIC9K中,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P.pastorisGS115。筛选出整合型His⁺Mut^s 菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明HIP在毕赤酵母中能有效分泌表达。对毕赤酵母中外源基因的稳定性进行了研究,结果表明外源基因在毕赤酵母中很稳定.     

人防御素HNP4在毕赤酵母中的表达

为了构建人防御素HNP4重组毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPIC9K-HNP4,建立高效、稳定表达人防御素HNP4的毕赤酵母表达菌株,并对表达产物进行检测与分析.利用PCR技术从pUC18-HNP4上扩增人防御素HNP4,构建人防御素HNP4重组表达载体pPIC9K-HNP4.SacI线性化后电击法转化入毕赤酵母GS115中,再通过同源重组到酵母染色体上,用G418筛选高表达菌株,在三角摇瓶中0.5%甲醇诱导表达.SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物,用标准大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌株混菌板鉴定活性.结果显示,SDS-PAGE和Western-blotting可检测到大小4.0 kDa左右的目的蛋白条带,表达量可达到500 mg/L,表达的重组人防御素HNP4具有较强的杀菌或抑菌活性.提示成功构建人防御素HNP4重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-HNP4,并建立高效、稳定表达有明显抗菌活性的重组人防御素HNP4的毕赤酵母表达菌株.