肿瘤坏死因子-α对日本血吸虫雌虫产卵量影响的研究

离休的日本血吸虫雌性成虫在含肿瘤坏死因子(TNF—α) 的培养液中培养72h后,产孵量明显高于不含TNF—α的对照组.在TNF—α为 10ng/ml～40ng/ml范围内,雌虫产卵量与TNF—α呈剂量依赖性.感染血吸虫的小鼠经尾静脉反复注入多克隆抗TNF—α抗血清后,其肝脏减卵率达28.4%.结果提示TNF—α具有促进雌虫产卵的作用.     

日本血吸虫平衡型核苷转运蛋白3基因(SjENT3)的RNA干扰研究

血吸虫以雌雄合抱的方式生存,雌虫在合抱后才能发育成熟,雄虫通过某种非精子传递的机制调控血吸虫雌虫的生长发育,而成熟雌虫所产大量虫卵是血吸虫导致宿主严重病理损害和疾病再传播的根源,因此,了解雄虫对雌虫发育的调控对血吸虫的致病和传播具有重要意义.本实验室前期蛋白质组学研究结果显示日本血吸虫ENT3蛋白(SjENT3)在两性感染的合抱雄虫体内的表达高于其在单性感染雄虫体内的表达.本研究通过qRT-PCR发现SjENT3基因在日本血吸虫虫体各个检测时间点均转录,从7d到21d逐渐升高,在21d转录水平达到最高,随后逐渐下降;SjENT3基因在18,21,25,28,35,42d在合抱雄虫体内转录水平明显高于合抱雌虫;对合抱雄虫与单性感染雄虫转录水平分析发现其在21d,23d,25d3个检测时间点与蛋白质组学结果一致,在合抱雄虫体内高表达.利用筛选出效果较好的siRNA对SjENT3在血吸虫体内的转录进行长期干扰,结果发现:特异siRNA干扰显著影响SjENT3转录水平,和NC对照组相比,干扰引起宿主虫荷率下降24.44%(P0.05),宿主肝脏荷卵率下降57.47%(P0.01),干扰后雌虫肝产卵能力下降42.28%(P0.01).本研究结果初步表明SjENT3基因参与日本血吸虫尤其是雄虫的生长发育,并可能与血吸虫雌雄虫合抱及其相互间信息传递有一定的关系.     

LTB的表达及其粘膜免疫佐剂活性分析

粘膜免疫是预防一些通过吸附粘膜组织侵入机体病原的很好措施,但粘膜免疫通常需要粘膜免疫佐剂,大肠杆菌(Escherichia coli)不耐热肠毒素的B亚基具有很好的粘膜免疫佐剂活性.本研究从大肠杆菌195菌株中扩增出LT(heat-labile enterotoxin)基因,测序后将其B亚基基因与pET32a连接构建了重组质粒pET32a-LTB,SDS-PAGE显示LTB(heat-labile enterotoxin B subunit)在原核细胞中得到表达,Western blotting和人神经节苷脂结合酶联免疫吸附试验(GM1-ELISA)结果表明,重组LTB具有抗原性和GM1结合活性.将其与禽流感M2e表位融合蛋白M2eHBc+混合通过滴鼻途径免疫小鼠,抗体检测结果表明,所表达的LTB能很好地提高共免疫抗原的粘膜和系统免疫应答.     

重组IL-5质粒pVAX1-mIL-5增强卵透明带DNA避孕疫苗黏膜免疫效能

目的:探讨利用白细胞介素5作为DNA疫苗佐剂增强黏膜免疫反应,提高卵透明带DNA避孕疫苗抗生育效能的可行性。方法:用pVAX1-m IL-5和卵透明带避孕疫苗pVAX1-pZP3α壳聚糖纳米微粒口服免疫雌性小鼠,共设3组,每组6只。A组单独用50μg pVAX1-pZP3α免疫;B组用疫苗加等量的pVAX1-m IL-5质粒为佐剂共免疫;C组为空白对照组。每组动物接受3次免疫(第0、3、6周)。采用ELISA法检测小鼠血清及阴道冲洗液中抗pZP3 IgA抗体。第10周雌雄交配,统计雌鼠怀孕情况;第16周取双侧卵巢作石蜡连续切片,光镜观察卵巢病理学变化。结果:B组全部小鼠血清抗体呈阳性反应,A组只有3只小鼠血清抗体呈阳性反应,且B组小鼠的抗体滴度水平均高于A组小鼠;抗生育率B组小鼠为100%,A组小鼠为50%,C组小鼠为0%,2检验分析结果表明各组间的差异有统计学意义,抗生育效能与交配时抗pZP3 IgA抗体的强度有关;卵巢切片的组织病理学观察结果表明,有抗生育效能的小鼠卵巢组织可观察到各级形态正常的卵泡,无淋巴细胞浸润,与对照组及无抗生育效能的小鼠卵巢结构无差异。结论:利用重组质粒pVAX1-m IL-5与卵...     

日本血吸虫童虫在东方田鼠和昆明小鼠中的蛋白差异初探

东方田鼠具有天然抗日本血吸虫活性,为了筛选抗日本血吸虫疫苗分子,通过日本血吸虫尾蚴感染东方田鼠和昆明小鼠,感染11天后收集东方田鼠和昆明小鼠肝童虫．肝童虫经组织匀浆收集蛋白质并进行蛋白质定量后SDS-PAGE分离,切取差异蛋白条带进行蛋白质鉴定．发现差异蛋白主要为日本血吸虫结构蛋白,能量代谢相关蛋白以及热休克蛋白等．为进一步研究抗日本血吸虫疫苗奠定了基础．     

日本血吸虫Sj23与IL-12多价DNA疫苗的构建

构建能共同表达日本血吸虫23kDa膜抗原(Sj23)与细胞因子IL-12的多价DNA疫苗．RT-PCR的方法从日本血吸虫成虫获得Sj23的基因片段,克隆到载体pVIVO2-mIL12／mcs上,进行酶切和测序鉴定．采用免疫荧光的方法检测多价DNA疫苗pVIVO2-Sj23-IL12在小鼠骨骼肌细胞的表达．成功地构建了能共同表达日本血吸虫23kDa膜抗原(Sj23)与细胞因子IL-12的多价DNA疫苗．此多价DNA疫苗在免疫小鼠肌细胞的细胞膜和细胞浆均获得了Sj23的表达．     

鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗油乳佐剂的筛选及免疫效果评价

为了对比筛选出鸡传染性鼻炎(IC)三价灭活疫苗的最适油乳佐剂,使用三种不同的油乳佐剂制备了3批鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)三价灭活疫苗,并对疫苗的物理性状、安全性及免疫效力进行检测.结果 显示,三种佐剂制备的疫苗均为稳定的油包水乳剂,而佐剂3组的黏度(29.3 Pa.s)显著低于其余两种佐剂组(184.2 Pa.s...     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增及克隆

目的:扩增和克隆日本血吸虫卵壳蛋白编码基因(SjESG),以研究其作为候选疫苗分子和药物靶点的可能性.方法:合成引物,以日本血吸虫雌、雄虫cDNA第一链为模板,RT-PCR扩增日本血吸虫卵壳蛋白编码基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建原核表达重组质粒,并经限制性核酸内切酶酶切分析和PCR鉴定.结果:从雌虫cDNA中扩增出624bp SjESG基因,原核表达重组质粒pET32a(+)-SiESG经限制性核酸内切酶酶切和PCR均获得624bp的DNA片段.结论:成功构建原核表达重组质#ipET32a(+)-SjESG.     

不同化学激活方法对小鼠卵母细胞孤雌激活效果的影响

通过比较几种常用的化学激活方法对小鼠卵母细胞的孤雌激活和孤雌生殖胚胎体外发育的影响,从而筛选出小鼠卵母细胞孤雌激活的适宜方法.选取成熟小鼠卵母细胞,随机分为以下9组进行激活处理:①离子霉素(I)+6-二甲氨基嘌呤(D);②I+D+细胞松弛素B(CB);③I+放线菌酮(C);④I+C+CB;⑤φ(乙醇)=7%的乙醇(E)+D;⑥E+D+CB;⑦E+C;⑧E+C+CB;⑨Sr2++CB.比较了这9种化学激活方法以及SrCl2的作用时间和卵龄对小鼠卵母细胞激活效果的影响.实验结果表明:小鼠卵母细胞孤雌激活率与激活措施和卵龄有关;小鼠卵母细胞可以被I+D+CB或SrCl2+CB有效激活,激活率及孵化囊胚发育率均高于其他激活方法(P0.05),且以SrCl2+CB最为有效.hCG注射后20h为小鼠卵母细胞进行SrCl2激活的最适卵龄,其最佳处理时间为4h.对小鼠卵母细胞而言,6-DMAP比放线菌酮的激活效果好.     

制备具有明显OVA吸附作用的Al(OH)_3佐剂及其在变应性鼻炎大鼠模型建立中的应用

目的:制备可明显吸附卵清蛋白(OVA)的Al(OH)_3佐剂并用其建立具备变应性鼻炎(AR)临床客观特征的大鼠模型.方法:通过控制反应条件制备可明显吸附OVA的Al(OH)_3佐剂,对模型组用OVA辅以自制Al(OH)_3佐剂进行基础致敏,继以质量分数为2%OVA生理盐水行鼻内激发.对照组以生理盐水替代自制Al(OH)_3佐剂.采用PCA、行为学评分、Luna染色、HE染色评价模型.结果:1)吸附研究表明自制Al(OH)_3佐剂对OVA具明显吸附作用;2)模型组:PCA(+)证明变应原特异性Ig E产生;行为学评分5分;Luna染色与HE染色示鼻黏膜嗜酸性粒细胞增多、浸润.对照组无上述变化.结论:所制Al(OH)_3佐剂对OVA具明显吸附作用并在此基础上成功建立了具备Ig E阳性和鼻黏膜嗜酸性粒细胞增多AR临床客观特征的大鼠模型.     

曼氏血吸虫单克隆抗体与日本血吸虫抗原的反应

用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测曼氏血吸虫单克隆抗体(Mc Ab)H417与日本血吸虫31/32kd抗原、斯氏狸殖吸虫成虫粗抗原、旋毛虫幼抗原及猪囊虫抗原的反应,结果显示,Mc AbH417旋毛虫、斯氏狸殖吸虫及猪囊虫抗原反应时,其消光值极低,而当日木血吸虫抗原与Mc AbH417反应时,其消光值读数较高,且与抗原稀释度呈线性关系.结果提示,抗曼氏血吸虫的Mc AbH417能识别异源性血吸虫抗原.     

绿脓杆菌外毒素A与Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白嵌合表达质粒的构建及其免疫原性的研究

构建外毒素结构域Ⅰ a基因(EPA103)与Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-2-gD)嵌合蛋白表达载体(pET-EgD),得到嵌合表达蛋白.利用外毒素结构域Ⅰ a基因表达蛋白的佐剂效应,以pET-EgD表达嵌合蛋白免疫Balb/c小鼠.结果显示:嵌合表达蛋白(pET-EgD)免疫小鼠,可在小鼠体内诱导产生抗HSV-2特异性抗体.嵌合表达蛋白(pET-EgD)具有较强的免疫原性,为开发研究Ⅱ型单纯疱疹核酸疫苗奠定了基础.     

甘油-3-磷酸对甲肝疫苗诱导的体液免疫影响*

目的 研究甘油-3-磷酸对甲肝疫苗诱导的小鼠体液免疫应答的影响。方法 选取49只雌性ICR小鼠,分7组,每组7只,这7组小鼠分别为阴性对照、单纯抗原组、铝佐剂组和4组甘油-3-磷酸组,分别在免疫之后的第4、8、12、16、20周用酶联免疫法(ELISA)测定小鼠血清中的特异性的anti-HAV IgG水平。结果 在小鼠免疫之后的第4、8、12、16、20周单纯抗原组、铝佐剂组和4组不同剂量甘油-3-磷酸组均能检测到特异性抗HAV抗体,并且趋势为先升高后降低,且在免疫后的第8周最高;第4周和第8周的甘油-3-磷酸实验组的结果均高于单纯抗原组,且差异均具有统计学意义(P<0.05),并且第4周甘油-3-磷酸组抗体水平均超过铝佐剂组,并具有统计学意义(P<0.05),其中甘油-3-磷酸2 mg为最佳剂量组,其抗体水平在免疫后的第4、8、12、16、20周均高于单纯抗原组,且在第8周抗体水平达到峰值,抗HAV IgG水平为lg(3.064±0.07851),铝佐剂的也是在第8周抗体水平达到峰值,抗HAV IgG水平为lg(3.150 ±0.1382)。结论 甘油-3-磷酸有免疫佐剂的作用,能够有效、迅速地增强HAV诱导的体液免疫应答,是一种潜在、安全有效的新型疫苗佐剂。     

吐温80对99mTc-替曲膦脂溶性、血浆蛋白结合及生物分布的影响

通过向心肌灌注显像剂99mTc-替曲膦注射液中加入吐温80溶液得到99mTc-替曲膦+吐温80(w=0.1%)混合注射液. 对这2种注射液的脂水分配系数、血浆蛋白结合的测定以及小鼠体内的生物分布实验表明,吐温80的引入使配 合物99mTc-替曲膦的脂溶性、血浆蛋白结合及生物分布均发生了改变. 与未加 吐温80的99mTc-替曲膦注射液相比,混合注射液的生物性能得到明显改善,主要表现为肝摄取率的降低和心/肝摄取率比值的增加.     

食物浓度对萼花臂尾轮虫种群增长、个体大小和卵大小的影响

以浓度分别为3.0、6.0、9.0、12.0和15.0×106 cells/ml的蛋白核小球藻为食物,在温度为25±1℃下对萼花臂尾轮虫进行群体累积培养研究.结果表明,食物浓度对其种群增长率、体长和卵体积均有极显著影响;种群增长率、体长和卵体积皆随食物浓度的升高而增大.其中种群增长率(Y,d-1)与食物浓度(X,×106 cells/ml)间的关系为Y=0.1768+0.0565X;体长(L,μm )与食物浓度(X,×106 cells/ml)间的回归方程为L=138.1577+4.8279X;卵体积(Ve,×103 μm3)与食物浓度(X,×106 cells/ml)间的关系可描述为Ve=375.8776+19.9560X.此外卵体积(Ve,×103 μm3)与体长(L,μm )间呈显著正相关,两者间的关系符合方程Ve=29.3382+2.8971L.     

细粒棘球蚴重组蛋白14-3-3和Eg10免疫差异的初步研究

表达纯化细粒棘球蚴重组蛋白14-3-3(rEg14-3-3)和Eg10(rEg10),分别免疫小鼠,8w后进行细粒棘球蚴原头蚴攻击感染.计算免疫保护力,检测脾组织中CD4+T、CD8+T细胞亚群以及T细胞增殖情况.实验结果表明,rEg14-3-3免疫组小鼠具有85.3%抵抗细粒棘球绦虫感染的能力,而rEg10免疫组小鼠与对照组小鼠相比无免疫保护力;与PBS对照组相比,只有rEg 14-3-3免疫组的CD4+T细胞亚群的分布有明显差异,且rEg 14-3-3抗原能诱导淋巴细胞显著增殖.因此rEgl4-3-3蛋白能抑制细粒棘球蚴的生长,诱导小鼠产生高水平的免疫保护力,可作为疫苗候选分子.     

灭幼脲对桑天牛成虫的生物活性

用经 5 0 0mg/kg的灭幼脲处理的构树枝条饲养桑天牛成虫后进行交错配对实验 :处理雄虫 (T♂ )×处理雌虫 (T♀ )、对照雄虫 (U♂ )×处理雌虫 (T♀ )、处理雄虫 (T♂ )×对照雌虫(U♀ )、对照雄虫 (U♂ )×对照雌虫 (T♀ ) ,并对各处理组的成虫寿命、产卵量、子代卵孵化率、孵化历期进行测定。结果表明 ,灭幼脲处理桑天牛后成虫寿命比对照成虫缩短 6～ 7d ;处理各组产卵量下降 ,其中T♂×T♀组比对照组降低 2 8.71 % ;T♂×T♀及U♂×T♀两组子代卵的孵化率分别比对照组下降 61 .0 3%和 61 .5 2 % ;灭幼脲处理后子代卵的孵化历期都比对照组子代卵延长 ,分别为 1 2 .38,1 1 .93及 1 1 .64d ,而对照为 1 1 .1 8d     

粘膜佐剂霍乱毒素B亚单位的克隆与表达

目的 :构建表达粘膜佐剂霍乱毒素B亚单位 (CTB)基因的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白。方法 :用PCR方法从霍乱弧菌中扩增CTB片段 ,将其转入原核载体质粒pET-32a( ) ,在大肠杆菌Top10克隆 ,并在BL21中表达。结果 :重组质粒PET-CTB的全长序列经分析与基因文库公布的一致 ;表达蛋白经SDS-PAGE分析 ,相对分子量与文献相符 ;重组蛋白竟Westernblot检测有抗原性。结论 :基因重组菌表达的CTB蛋白可能作为有效、安全的粘膜佐剂用于口服疫苗的研制     

瘦素基因佐剂对小鼠抗原提呈细胞表型的影响

目的:研究瘦素(Leptin)基因佐剂在体内对抗原提呈细胞的影响。方法:根据小鼠瘦素基因设计引物,采用RT-PCR方法获得瘦素cDNA,与pVAX1连接构建瘦素真核表达载体作为基因佐剂,制备无内毒素重组质粒,转染B16细胞鉴定瘦素的表达,并采用肌注方式分析瘦素基因佐剂在体内对小鼠抗原提呈细胞表型的影响。结果:克隆得到的瘦素编码区全长序列,经DNA测序后证明与已报道序列相同,成功构建小鼠瘦素的真核表达载体,可在B16细胞表达;瘦素基因佐剂在体内对CD3-CD19-CD11c+细胞的MHC II和CD83的表达无明显影响,但能显著上调CD3-CD19-CD11c-免疫细胞表面MHC II类分子的表达。结论:成功构建小鼠瘦素基因佐剂,体内试验可促进免疫细胞上调MHC II类分子,提示瘦素基因佐剂有可能通过增强免疫细胞尤其是抗原提呈细胞的活化而促进免疫应答。     

卵细胞体外成熟(IVM)在小鼠生物净化中的应用

目的 在小鼠生物净化中,从超排后未排卵的卵巢,取卵泡内未成熟卵采用卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)使之在体外成熟并具备受精能力,以提高卵子利用率和作为常规促超排失败的一种补救措施。方法 在小鼠生物净化中,取注射PMSG和HCG后未排卵卵巢,在实体显微镜下划破卵泡挑选卵丘卵母细胞复合物(COCs),置于成熟液滴中在体外发育成熟。同时以注射PMSG和HCG后正常超排卵、只注射PMSG后取未成熟卵体外成熟和注射PMSG和HCG后取疑似成熟卵和裸卵体外成熟作为对照。经体外受精、体外胚胎发育后,将2-细胞胚移植到受体输卵管,使其在受体内发育成为成熟的个体。结果 注射PMSG和HCG后未排卵组(A组),卵细胞体外成熟率为87.0%±3.2%,二胞率为55.1%±12.3%,囊胚率为23.1%,移植41枚二细胞胚至2只受体鼠,出生5只幼崽,产仔率12.2%。只注射PMSG,48 h后取未成熟卵组(B组),体外成熟率为83.9%±3.9%,二胞率为51.8%±9.3%,囊胚率为38.5%±13.9%。注射PMSG和HCG正常超排组(C组),其二胞率为78.9%±0.6%,囊胚率为78.0%±3.8%。注射PMSG和HCG未排卵卵巢,取裸卵和疑似成熟卵(D组),体外成熟培养0 h,6 h和16～18 h,其成熟率、二胞率和囊胚率与其它三组相比均较低且有极显著性差异。A组和B组与正常对照C组相比,二胞率均有显著性差异,囊胚率均有极显著性差异。结论 卵母细胞体外成熟(IVM)可以作为小鼠生物净化中促超排失败的一种补救措施,并且可以提高珍稀品系小鼠的卵子利用率。