结核分枝杆菌新型亚单位疫苗的初步研究

为了研发结核新型亚单位疫苗,以纳米颗粒为载体展示结核分枝杆菌主要抗原ESAT6.将ESAT6基因片段克隆到位于pGEX-4T-1载体上的诺如病毒P结构域的Loop2中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,用GST亲和柱纯化,并通过FPLC分析嵌合纳米颗粒的形成效率,最后免疫BALB/c小鼠进行免疫原性的评价.结果表明:研究成功地将ESAT6基因克隆至诺如病毒P结构域的Loop2中,且空间结构模拟提示ESAT6能展示在P纳米颗粒的表面. FPLC分析表明,表达的嵌合蛋白可以高效地自我组装成纳米颗粒.用该嵌合颗粒免疫小鼠后,能诱导产生针对ESAT6重组嵌合颗粒的特异性抗体.进一步分析发现,诱导的抗体主要针对ESAT6的51～70肽段,而不是1～20肽段.综上,研究通过诺如病毒P颗粒成功地展示了结核分枝杆菌主要抗原ESAT6,为进一步研发结核新型亚单位疫苗奠定了基础.     

小鼠胎肺Ⅲ型上皮细胞的分离纯化及原代培养

用免疫黏附和差速离心法分离和纯化小鼠胎肺Ⅱ型细胞,所得细胞纯度达(90±2)%,产量为每5只小鼠胎肺收获(23.6±7)×106个细胞.原代培养的小鼠胎肺Ⅱ型细胞在12～24 h 开始贴壁,在36～48 h呈指数生长,72 h后生长减缓,4～5 d左右细胞开始变形分化.免疫荧光鉴定胎肺Ⅱ型细胞表面活性蛋白C(SP-C)染色阳性,透射电镜观察到细胞内板层小体,细胞中proSP-C蛋白在培养48 h后表达较高.体外病毒转染成功,可见强烈荧光表达.成功建立了小鼠胎肺Ⅱ型上皮细胞的培养模型.     

LIM结构域蛋白KyoT基因剔除小鼠的建立和表型分析

KyoT为一LIM结构域蛋白,可与转录因子RBP-Jk相互作用而调节其转录活性.构建了KyoT基因剔除载体,转染小鼠胚胎干细胞(ES细胞)后得到同源重组的ES细胞克隆.将此ES细胞注射入小鼠的囊胚泡得到嵌合小鼠,再经小鼠培育得到KyoT基因被剔除的小鼠.纯合子KyoT基因剔除小鼠不能表达有功能的KyoT蛋白.表型分析表明纯合子KyoT基因剔除小鼠腹腔B1B细胞数增加,提示KyoT可能参与B淋巴细胞的发育.     

小鼠单纯疱疹病毒Ⅰ型心肌炎与心肌细胞凋亡和c-Myc蛋白表达的关系

为了探讨小鼠单纯疱疹病毒Ⅰ型心肌炎与心肌细胞凋亡和cMyc蛋白的表达的关系,给BALB/C小鼠腹腔接种单纯疱疹病毒Ⅰ型以诱发其急性病毒性心肌炎(VMC),感染病毒3～35天后,VMC检出率为91.67%。应用电镜、原位末端标记法(TUNEL)及免疫组化技术检测发现,感染鼠心肌中有细胞凋亡和cMyc蛋白的表达,二者阳性率分别为78.33%和81.67%,凋亡细胞阳性指数(AI)范围在34.14±11.56～26.41±10.2之间。细胞凋亡和cMyc蛋白可能参与VMC的发生与发展。     

小鼠胚胎脑特异表达的新基因bsg3的克隆及初步研究

通过消减差异筛选的方法克隆到一个在小鼠胚胎脑特异表达的基因bsg3(brain specific gene 3).它编码的蛋白与人的KIAA0961具有80.3%的同源性.bsg3基因包含一个1644bp的完整阅读框,编码一个含548个氨基酸,具有1个KRAB结构域(kruppel-associated box)和13个C2H2型锌指结构域的蛋白.该基因定位在小鼠第7号染色体上,包含5个外显子,4个内含子.以bsg3基因全长编码区为探针的原位杂交结果显示,bsg3在小鼠胚胎脑及鸡胚脑特异表达.半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的结果表明,在成体小鼠的组织中,bsg3基因脑中表达也较强.这提示bsg3基因可能在小鼠脑发育中起着重要的作用.对bsg3基因时间和空间的表达模式的分析将有助于进一步揭示它在脑发育及功能维持中的作用.     

血管紧张素Ⅱ诱导小鼠心肌肥大差异表达蛋白的鉴定与分析

采用蛋白质组学方法研究血管紧张素(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱导小鼠心肌肥大模型中心脏蛋白差异表达的变化情况并探讨其病理生理学意义.构建AngⅡ诱导的小鼠心肌肥大模型,提取小鼠的心脏蛋白,采用双向电泳技术分离差异表达的蛋白,凝胶考染后切取差异蛋白点进行质谱检测(MALDI-TOF)分析,获取的数据采用Mascot软件在NCBInr数据库内检索.结果发现AngⅡ模型组小鼠心脏蛋白图谱中有34个蛋白点表达量与对照组有显著差异,质谱鉴定出14种差异表达的蛋白,其中高表达的蛋白有2个,低表达的蛋白有12个.AngⅡ诱导小鼠心肌肥大模型中表达有差异的蛋白主要与能量代谢、氧化应激和细胞骨架有关.     

抗Y-box结合蛋白冷休克域单克隆抗体的制备及其初步应用

固相法合成Y -box结合蛋白冷休克域部分片段“14肽”(H2 N NGYGFINRNDTKED COOH ,简称ND) ,用不同载体蛋白经戊二醛一步法偶联得到免疫抗原 (BSA ND)和检测抗原 (OVA ND) .用免疫抗原免疫BLAB c小鼠 ,经间接法ELISA检测 ,得到对ND有足够免疫应答的小鼠 .采用常规单克隆抗体制备的方法 ,得到 3株能稳定产生和分泌抗ND单抗的克隆细胞株 ,单抗的亚型均为IgM .WesternBlotting结果显示 :该单抗能识别中华大蟾蜍 (Bufobufogar garizans)Ⅰ、Ⅱ期卵母细胞中的热稳定Y box结合蛋白p5 4 ,并能识别中华大蟾蜍高、低温卵中一种分子量约为 80kD的蛋白 (简称p80 ) .由于p80在低温卵中含量高于高温卵中 ,推测可能是高温卵和低温卵中差异表达的Y box结合蛋白之一 .     

鳗鲡病原菌二联外膜蛋白基因工程表达载体的构建

根据鳗鲡病原性嗜水气单胞菌Ⅱ型孔蛋白(porinⅡ)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白S(ompS2)的基因全长序列,分别选取这两个全长序列中表达其蛋白质膜外部分且理论免疫原性较好的两个基因片段,通过融合PCR技术连接这两个外膜蛋白基因片段.根据表达载体(pGEX-2T-His)的限制性酶切位点在连接序列片段的两端引入限制性酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ,成功构建了双外膜蛋白基因片段重组表达载体(pGEX-2T-His-porinⅡ-ompS2).表达载体理论表达产物的蛋白质结构预测表明表达产物无信号肽和跨膜区,不存在三级结构;亲水性和免疫原性预测分析表明该表达蛋白理论上为可溶性蛋白并具有丰富的抗原决定簇,本研究为该表达载体的蛋白表达、纯化以及表达产物的免疫原性研究奠定了基础.     

Ⅰ型单纯疱疹病毒包膜糖蛋白L基因片段的克隆及高效表达

 采用PCR方法扩增HSV-1病毒型特异性包膜糖蛋白L(gL)基因片段并克隆至原核表达载体pGEX-5X-1获得重组质粒pGEX-5X-1-gL,将重组质粒转化E.coli BL21表达菌后经IPTG诱导表达目的蛋白.SDS-PAGE蛋白检测表明,在分子质量56 ku处有HSV-1 GST-gL融合蛋白的高效表达,通过IPTG浓度筛选和诱导前表达菌扩增培养时间的比较分析对诱导条件进行了优化,GST-gL融合蛋白表达量可达到菌体蛋白总量的48.65%.Western blot中利用HSV-1灭活病毒获得的多克隆抗体确证所表达蛋白为HSV-1病毒组分.这一表达系统的建立和优化对进一步探讨HSV-1 gL蛋白功能及其免疫原性提供了有利条件.     

一种靶向FAP的蛋白疫苗设计及其抗肿瘤保护研究

设计了一种成纤维细胞活化蛋白(FAP)催化结构域与白喉毒素跨膜结构域(DTT)融合的蛋白疫苗并研究了其抗肿瘤保护效果.通过基因重组,构建了FAP催化结构域与DTT的融合蛋白DTT-FAP.融合蛋白经大肠杆菌表达后,由GST柱进行亲和纯化.DTT-FAP免疫Balb/c小鼠后,接种结肠癌CT26实体瘤.ELISA检测血清效价,并研究其抗肿瘤保护效果.DTT-FAP引起了相应的免疫反应,血清效价约5×103.该疫苗显著抑制CT26肿瘤生长(p<0.01),并显著提高小鼠生存率(p<0.01).本研究首次构建了以FAP为靶点的蛋白疫苗DTT-FAP,该疫苗可引起小鼠针对人FAP的免疫反应,并对结肠癌CT26实体瘤有显著抗肿瘤保护效果.     

血管内皮生长因子C嵌合体（CA65）转基因小鼠的建立和分析

将血管内皮生长因子C嵌合体CA65插入角蛋白14（keratin 14,K14）启动子下游,构建了嵌合体CA65转基因表达载体,通过显微注射法建立转基因小鼠.利用特异引物聚合酶链式反应法鉴定转基因小鼠的基因型后,通过逆转录聚合酶链式反应检测嵌合体CA65的表达水平,证实成功建立了皮肤特异表达嵌合体CA65转基因小鼠.对...     

植物嵌合体机理及研究进展

植物嵌合体是自然界中广泛存在的一种遗传镶嵌形式，它对于研究植物生长发育过程中细胞间的相互作用十分有价值，综述论述了植物嵌合体的结构特点、产生原因和遗传机理，并对其在植物发育研究中的重要作用和嵌合体的分子分析作了一些介绍。     

GFPT2基因系统发育与功能生物信息学分析

GFPT2作为己糖胺代谢重要的转录因子,在动物的多种疾病发生发展中起着重要作用。利用生物信息学方法对GFPT2蛋白的组分、功能、正选择位点及其分子进化进行了详细的分析。结果表明:13条不同物种氨基酸序列组分分析显示亮氨酸占比最高为9.86%,含量最低的氨基酸为色氨酸(0.15%),平均长度为664.8。系统进化树和结构域显示人和猴子的亲缘性最近,其次是大鼠、小鼠,所有氨基酸均包含两个SIS保守结构域。混合效应-演化模型(mixed effects model of evolution, MEME)和固定效应(fixed effects likelihood, REL)方法共发现8个正选择位点。基因本体论(gene ontology, GO)功能富集分析发现GFPT2主要参与GFPT酶活性、蛋白结合、碳水化合物衍生物结合方面发挥作用等生物学过程。京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of gene and genomes, KEGG)分析显示差异基因主要参与氨基糖和核苷酸糖代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,胰岛素抵抗3条信号通路。并且筛选到与GFPT2相互作用的10个基因:GFPT1、GLUL、GNPDA1、GNPNAT1、GPI、HK1、MPI、PPAT、AMDHD2、CAD。研究结果可以为GFPT2分子功能的深层次研究提供一定的借鉴作用,对进一步探究由己糖胺代谢导致的代谢异常及心血管疾病治疗具有重要的现实意义。     

实现人源FGF-21高效可溶性表达的两种策略

采用分子伴侣协助蛋白表达的方法及乳糖自诱导的策略,实现人源FGF-21在大肠杆菌中的高效可溶性表达.结果显示,在分子伴侣Tig的协同表达下,融合蛋白TrxA-FGF-21可溶性达到92.4%.采用乳糖自诱导策略,融合蛋白TrxA-FGF-21表达量达到17.4%左右,菌体〖WTBX〗OD〖WTBZ〗600达到12.4,可溶性TrxA-FGF-21相对产量是IPTG诱导发酵条件的5.5倍.该方法制备的重组FGF-21在C57BL/6小鼠体内具有降低血糖的生物学活性,甘油三酯水平与对照组相比也表现极显著差异(〖WTBX〗P〖WTBZ〗<0.01).     

Genetic defect in secretion of complement C5 in mice.

A genetic deficiency of the fifth (C5) component of complement1-3, a serum glycoprotein of molecular weight (MW) 220,000 (ref. 4), has been found in 39% of inbred strains of mice3. Sera of deficient mice lack detectable C5 activity and protein2,3. In addition deficient mice produce antibody to mouse C5 when injected with sera from C5 sufficient (normal) strains. Levy et al.5 showed that somatic cell hybrids between C5 deficient (B10.D2/old line) macrophages and either C5 sufficient (B10.D2/new line) mouse kidney or chicken erythroblasts secreted haemolytically active mouse C5 in vitro. Several possible molecular mechanisms to account for the findings were considered, but insufficient direct data were available to choose among them. We recently reported that mouse (CD.1 strain) peritoneal cells in culture synthesise and secrete a single chain precursor, pro-C5 (MW approximately 210,000), of the two-chain (alpha chain, 125,000 and beta chain 83,000 MW) C5 protein6. Radiolabelled precursor C5 was contained within the cells and was secreted into the tissue culture media. Using similar methods, we now find that C5 deficiency in each of five different mouse strains (AKR, SWR, DBA/2J8 A/HeJ and B10.D2/old line) is due to a failure in secretion of C5 protein and not to a failure in biosynthesis of pro-C5.     

iRhom2Uncv 小鼠乳腺发育障碍的转录组分析

摘要:目的 研究 iRhom2Uncv 小鼠乳腺表型相关的差异表达基因,为深入研究 iRhom2Uncv 小鼠乳腺发育障碍的相关机制提供靶点信息。 方法 对 12 周龄的野生型和 iRhom2Uncv 小鼠的乳腺组织进行 whole-mounts 染色,分析乳腺发育形态,收集乳腺组织进行转录组测序,筛选差异表达基因,ELISA 检测血清激素水平。 结果 与野生型小鼠相比,iRhom2Uncv 小鼠乳腺侧枝导管较稀疏,差异最显著的 18 个基因中有 6 个在 iRhom2Uncv 小鼠中表达上调,12 个表达下调。 其中 3 个催乳素家族基因在 iRhom2Uncv 小鼠中不表达,且在血清中几乎检测不到催乳素表达,而血清中的雌激素水平相比野生型小鼠较高。 结论 iRhom2Uncv 突变的小鼠存在乳腺发育障碍,可能与 iRhom2Uncv 小鼠中催乳素和 Zfp281 的缺失表达有关,生物信息学分析发现,iRhom2Uncv 小鼠神经发育可能存在不同于野生型小鼠的表型。     

褐绿色型与野生色型坛紫菜杂交产生嵌合体及其选育

以野生型坛紫菜为父本,人工选育的褐绿色型坛紫菜为母本进行杂交实验,获得大量的单色体和嵌合体,在其子一代中随机抽取1 147株藻体进行统计分析,并对生长性状好的藻体进行选育培养,结果显示:1)嵌合体色泽:主要为野生色+褐绿色、野生色+褐绿色+野生色、褐绿色+野生色+褐绿色;2)嵌合体的比例:单一色型藻体占14.5%,2种色泽相嵌的嵌合体占73.9%,3种色泽的嵌合体占10.6%,4种色泽的嵌合体占1.1%;3)嵌合方式:点状、线型、"V"字型、"W"字型和小叶片型等;4)通过营养细胞酶解和单性生殖所获得的单色藻体c,经培养后F1和F2代遗传性状比较稳定,有望筛选成为新的品系.     

重组金针菇免疫调节蛋白的纯化及生物活性研究

目的研究重组的金针菇免疫调节蛋白(re FIP-fve)对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用、诱导小鼠脾淋巴细胞对白细胞介素-2(IL-2)的促分泌作用及对血细胞的凝集作用.方法采用离子交换色谱法,利用SP Sepharose XL色谱柱纯化重组的免疫调节蛋白;将纯化后的蛋白作用于小鼠脾淋巴细胞和血细胞,用MTT法检测蛋白对脾细胞增殖和血细胞凝集的影响;用ELISA法检测蛋白对淋巴细胞分泌细胞因子的作用.结果经过SP Sepharose XL色谱柱纯化后可获得纯度为86%的重组蛋白;纯化蛋白浓度在80μg/m L时最大限度促进细胞增殖;蛋白浓度在2μg/m L时开始出现凝血;ELISA检测结果显示:重组的金针菇免疫调节蛋白能明显增强小鼠脾淋巴细胞分泌白细胞介素2(IL-2)的水平.结论经过SP Sepharose XL色谱柱纯化后可获得纯度较高的蛋白;纯化后的蛋白与小鼠脾淋巴细胞共同培养,不仅可以促进脾细胞的增殖,而且能增强小鼠脾淋巴细胞分泌白细胞介素2的水平;蛋白与血细胞共同培养能够促进血细胞的凝集.     

绿原酸对脂多糖致炎症小鼠体内体外COX-2的影响

探讨绿原酸对脂多糖致炎症小鼠体内体外COX-2蛋白表达的影响.脂多糖滴鼻造模建立小鼠急性肺损伤模型,脂多糖诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7建立细胞炎症反应模型,应用Weston blot法,检测小鼠肺组织内以及RAW264.7巨噬细胞中COX-2的蛋白表达.绿原酸在小鼠体内体外均能有效降低脂多糖诱导的COX-2的蛋白表达,并能促进COX-2蛋白的降解.降低脂多糖诱导的COX-2的蛋白水平是绿原酸抗炎的机制之一.     

金黄色葡萄球菌sPP2C的克隆、表达及性质研究

从金黄色葡萄球菌基因文库中克隆了一条新的双特异性磷酸酶，命名为sPP2C (protein phosphatase 2C, Staphylococcus aureus). sPP2C基因具有741个碱基，编码的蛋白有247个氨基酸，具有一个蛋白磷酸酶2C的催化结构域.sPP2C的分子量为26.1 kD，等电点为4.95.在E.Coli. Rossetta中表达蛋白sPP2C.高纯度的sPP2C用亲和层析的方法纯化得到.酶学研究结果表明：sPP2C对磷酸酶的通用底物硝基苯磷酸 (p-nitrophenyl　phosphate, pNPP)不起作用，而与pSer/Thr和pTyr的寡肽均有去磷酸化作用.这些实验结果说明sPP2C是一个新的双特异性磷酸酶.