根癌农杆菌介导的盐生杜氏藻DsNRT2基因转化紫花苜蓿的初步研究

利用根癌农杆菌介导法进行紫花苜蓿遗传转化研究.将从抗逆生物盐生杜氏藻中克隆得到的DsNRT2(码硝酸盐转运蛋白)导入紫花苜蓿"中苜一号"中,在含50 mg/L的卡那霉素的培养基上获得再生苗35株,经PCR和Southern杂交鉴定,得到7株阳性苗,表明DsNRT2基因已整合到苜蓿的基因组中.     

枯草杆菌纳豆激酶基因的克隆及其在E.coli BL21(DE3)plysS中的表达

用CTAB法从枯草杆菌(纳豆株)中提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增获得837bp的DNA片段,将该基因片断克隆到pMD18-T载体上,筛选重组子,通过限制性内切酶、PCR技术和测序分析确定该重组子所含插入片断为纳豆激酶基因．利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的融合表达载体,转化E．coli BL21(DE3)plysS后经IPTG诱导在大肠杆菌中高效表达,经SDS—PAGE电泳及bandscan软件分析融合蛋白分子量约为33．4kD,约占菌体总蛋白29．4％．     

苜蓿花叶病毒RNA2 3''''端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1／2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AIMV-Ch)RNA：3′端cDNA，重组到植物表达载体pROKⅡ中，通过致瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导，以叶圆片为转化材料，转化普通烟草，并获得了转基因植株．经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明．AIMV RNA：3′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中．转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性．     

3-酮基嘌呤还原酶(TSC10)基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

TSC10基因所编码的3-酮基嘌呤还原酶是酵母中神经酰胺合成的重要因子。设计了一种从酵母中提取神经酰胺经济、便捷、高效的方法:(1)利用构建含有TSC10基因的毕赤酵母GS115表达载体p PIC3.5K-TSC10;(2)电转化法将该表达质粒转化到GS115感受态细胞中;(3)用G418筛选以及PCR鉴定;(4)使用qRT-PCR和SDS-PAGE进行检测。结果经过G418筛选以及PCR鉴定后确定获得了包含TSC10基因的毕赤酵母转化子,经过qRT-PCR和SDS-PAGE进行检测后发现TSC10基因在20个阳性菌株中均可以稳定、高效表达。成功构建了3-酮基嘌呤还原酶高表达的毕赤酵母菌株,并为后续获得高收率神经酰胺奠定了基础。     

苜蓿花叶病毒复制酶基因全长cDNA植物表达载体的构建和对烟草的转化

将苜蓿花叶病毒中国分离株(Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，A1MV-Ch)的复制酶P2亚基(90 kD蛋白)基因的全长cDNA构建到植物表达载体pROKⅡ中，得到重组植物表达载体pAIMV-FL．用三亲融合法导入农杆菌LBA4404，并转化烟草，经PCR检测，获得了含全长cDNA的转基因烟草植抹．     

PCR法快速鉴定阳性克隆实验的改进

分析了常规PCR扩增鉴定阳性克隆实验中存在的问题,进行了改进探索:反转录PCR(RT-PCR)获得目的基因片段,TA克隆连接质粒载体、转化大肠杆菌感受态细胞;利用目的基因的特异性引物,用菌液PCR法直接筛选重组克隆,在筛选的阳性菌液中扩增到与目的基因片段大小一致的阳性条带,与质粒PCR及酶切的阳性对照一致,验证了菌液PCR具有可靠性。实验证明,自身引物菌液PCR法用于定性筛选重组阳性克隆,是一种简便、快速、有效的方法。     

口蹄疫抗原决定簇融合基因转化胡萝卜的研究

利用转基因植物生产疫苗是目前植物基因工程的一个研究热点，具有生产简单、成本较低、使用安全方便、易贮存等优点．本实验通过农杆菌介导的遗传转化．以O型和A型口蹄疫抗原决定簇基因O21-O14-A21转化胡萝卜．通过筛选．获得潮霉素抗性愈伤组织。经胚状体再生得到156棵抗性苗．通过GUS染色检测．GUS报告基因在部分转化的愈伤组织中瞬时表达．并在部分抗性苗中稳定表达．对部分抗性植株进行PCR和PCR—Southern杂交检测．证实目的基因已经成功整合到胡萝卜基因组中．     

农杆菌介导抗虫基因转化芥菜型油菜的研究

用农杆菌介导法对芥菜型油菜进行了转化，并对影响根癌农杆菌转化效率的因素进行了研究，建立了以油菜子叶柄为外植体的转化体系．用携带蝎毒素(BmKITs)和几丁质酶(chi)双价基因的农杆菌转化油菜，共获得了抗卡那霉素的再生苗153株，移栽成活21株．对成活植株进行了PCR分子检测，证实有外源基因的整合．转基因植株形态正常，开花、结实．     

荧光实时定量PCR检测紫花苜蓿DREB基因的方法

建立一种简便、快速、有效的检测紫花苜蓿DREB基因表达水平的荧光实时定量PCR方法.优化检测DREB基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测体系.运用建立的优化体系检测了低温处理后紫花苜蓿DREB基因表达情况.     

转抗虫融合基因(cry1Ac3-cpti)玉米(Zeamays L.)植株的获得及其抗虫性分析

将苏云金杆菌家族中的cry1Ac3基因与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)融合成融合基因，构建cry1Ac3-cpti融合基因植物表达载体，表达Bt-CpTI抗虫融合蛋白．用基因枪转化技术将cry1Ac3-cpti融合基因分别导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中，轰击后的愈伤组织经筛选剂3次筛选，获得可育的再生植株．经PCR及Southernblot分子检测，证实所获得的再生植株为转基因植株．抗虫性分析结果表明，部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性．将苏云金杆菌家族中的cry1Ac3基因与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)融合成融合基因，构建cry1Ac3-cpti融合基因植物表达载体，表达Bt-CpTI抗虫融合蛋白．用基因枪转化技术将cry1Ac3-cpti融合基因分别导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中，轰击后的愈伤组织经筛选剂3次筛选，获得可育的再生植株．经PCR及Southernblot分子检测，证实所获得的再生植株为转基因植株．抗虫性分析结果表明，部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性．     

一个水稻蛋白激酶的过表达分析及表达调控

对一个预测的具有光反应活性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶STK进行过表达研究,构建了STK过表达载体,并用农杆菌介导的方法进行遗传转化,获得T0代转基因植株.对转基因阳性植株进行表达分析的结果表明,转基因植株STK基因的表达量显著高于对照,说明目的基因得到了过表达.另外,利用获得的过表达转基因植株对STK调控水稻中光周期相关的开花基因Hd1和Hd3a的表达进行分析,结果表明,Hd1及Hd3a的表达在转基因植株中明显上调,表明该蛋白激酶的基因可能位于Hd1和Hd3a上游,对于Hd1和Hd3a的表达具有重要的调控作用.     

转基因小黑杨对土壤微生物群落结构的影响

为评价转基因林木环境释放可能引起的生态风险,以及转基因林木在生产应用中的可行性和可靠性,以实验室种植的转Bt-蜘蛛神经毒肽重组基因的小黑杨为材料,对转基因与非转基因植株根际(通常为几毫米至几厘米)土壤细菌、放线菌、真菌数量和基因水平转移情况进行检测,结果表明:转基因小黑杨种植一段时间后其根系附近的微生物数量略高于非转基因小黑杨。利用卡那霉素选择培养基分离根系周围细菌菌落发现转基因植株周围的土样细菌中,Kan^R抗性细菌菌落数占总细菌菌落的比例在11.58%～13.00%之间,而非转基因植株根际周围和空白土壤细菌菌落数则在5.73%～6.40%之间,表明转基因小黑杨根系对土壤细菌的抗生素抗性产生一定的影响。利用转基因植株的目的基因和抗性基因设计引物,以土壤中细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增,转基因植株种植7个月后,根际土壤细菌菌落中含有抗性基因的菌落数量明显增加。虽然在种植1个月的转基因植株根际土壤土样细菌中未检出目的基因,但在种植7个月后的土样中检验到了很少的目的基因阳性细菌,阳性细菌菌落比例为2%～5%,检测结果表明可能有极少数Bt-蜘蛛神经毒肽重组基因发生了水平转移。     

拟南芥AtPLC4基因RNAi载体的构建及遗传转化

利用RNAi技术,构建了AtPLC4基因的RNAi双元载体,并进行了拟南芥的遗传转化,通过抗性筛选及PCR鉴定,获得20株遗传转化株系.进一步通过RT-PCR检测,得到3株AtPLC4基因表达降低的转基因植株,为运用反向遗传学的方法深入研究AtPLC基因家族的生物学功能提供基础.     

害虫对转基因植物抗性进化的计算机模拟

采用人工生命的方法，定量模拟了不同条件下害虫对转基因植物抗性性的进化速度。结果显示只转入植物一个毒性基因常使害虫在短时间内产生抗性，若转３－４个不会产生交互抗性的毒性基因则可大大推迟到或阻止抗性的产生。     

应用农杆菌介导法的多年生黑麦草遗传转化研究

以草坪型多年生黑麦草Lolium perenne L.成熟种子为外植体,经过愈伤组织诱导和植株再生研究,建立了该草种的遗传转化体系,并成功地应用农杆菌介导法将克隆自辽宁碱蓬的甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)转移进多年生黑麦草,获得的转基因株系Gsc-LP5通过PCR检测证明了目的基因的存在,通过叶片离体检测法证明了作为检测基因随同质粒一同转入的抗潮霉素基因的表达,通过盆栽耐盐试验证明了转基因植株具有较强的耐盐能力.     

转AlNHX1基因大豆后代遗传稳定性及耐盐性分析

为了获得耐盐性有所提高的转AlNHX1基因大豆后代材料,以已获得的转AlNHX1基因的6个株系中的3个株系后代为研究对象,通过分别对这3个株系转基因大豆各后代进行PCR分子检测并结合耐盐性鉴定,以分析外源基因在转基因大豆中遗传稳定性和耐盐性.结果表明:AlNHX1基因在转基因植株的后代中遗传;选取3个株系中部分阳性植株做耐盐性检测,结果表明:转基因大豆耐盐性状均好于野生型大豆.在150mmol/L NaCl胁迫下,转基因大豆叶片中维持了相对较高的K+/Na+比值,相对含水量较野生型提高了9%,而渗透势降低了39%,表明转基因大豆具有较好的吸水和保水能力;在盐胁迫下,超氧化物歧化酶(SOD)与过氧化物酶(POD)活性较野生型大豆分别提高了45%与69%.综上,通过耐盐筛选获得的转AlNHX1基因大豆具有较强的耐盐性.     

Enhanced late blight resistance of transgenic potato expressing glucose oxidase under the control of pathogen-inducible promoter

To engineer crop disease resistance by utilizing natural defense mechanism that was expressed in the incompatible host-pathogen interactions is expected to result in a durable and broad-spectrum resistance. In order to prove this viewpoint, we amplified the coding region of the glucose oxidase (GO) gene from Aspergillus niger via PCR and fused it to the pathogen-inducible promoter, Prp1-1. The chimeric gene was cloned into a plant expression vector and conjugated into Agrobacterium. Twenty-three transgenic potato plants were obtained by Agrobacterium-mediated transformation. The integration of GO gene was confirmed by Southern hybridization and the GO gene expression was identified with KI-starch color reaction. Phytophthora infestans inoculation revealed that the expression of the chimeric transgene was induced by pathogen infection. Most of the transgenic plants exhibited various degrees of enhanced disease resistance. Four of them had lesion sizes reduced to less than half of the non-transgenic controls. One plant showed disease resistance of the hypersensitive response. These results testified the feasibility of our strategy of expressing GO transgene under the control of the disease-inducible promoter in engineering crop disease resistance.     

Transformation of GbSGT1 gene into banana by an Agrobacterium-mediated approach

SGT1 is a homologue of the yeast ubiquitin ligase-associated protein. It controls some protein degradation and activates defense pathway in plants. Cotton GbSGT1 gene (Gossypium barbadense) has been isolated and characterized in previous work. In this study, the plant expression vector pBSGT1 with bar gene as a selection agent was constructed and transgenic banana was obtained via Agrobacterium-mediated transformation with the assistance of particle bombardment and screened with PCR and Basta spreading on banana plant leaves. Estimating of transgenic banana plants for resistance to Panama wilt is in progress.     

Transformation of GbSGT1 gene into banana by an Agrobacterium-mediated approach

SGT1 is a homologue of the yeast ubiquitin ligase-associated protein. It controls some protein degradation and activates defense pathway in plants. Cotton GbSGT1 gene (Gossypium barbadense) has been isolated and characterized in previous work. In this study, the plant expression vector pBSGT1 with bar gene as a selection agent was constructed and transgenic banana was obtained via Agrobacterium-mediated transformation with the assistance of particle bombardment and screened with PCR and Basta spreading on banana plant leaves. Estimating of transgenic banana plants for resistance to Panama wilt is in progress.