枯草芽孢杆菌酶的还原性能及用于靛蓝染料还原

采用酵母浸粉、蛋白胨、琼脂粉等材料在特定的条件下培养枯草芽孢杆菌,使其分泌枯草芽孢杆菌酶,包括胞外酶和胞内酶;测试酶的导电能力及还原能力,结果表明:枯草芽孢杆菌胞内酶具有还原能力;当电源外加电压调至15 V时,胞内酶还原电位为867 mV,超过靛蓝所需要的还原电位-760 mV,枯草芽孢杆菌胞内酶可用做靛蓝电化学染色体系的还原剂,将其用于靛蓝电化学还原染色,发现当酶体系温度为60℃,pH为11,还原时间为40 min时,对靛蓝染料的还原效果较佳.     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合及高效表达

从中温α-淀粉酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)264中克隆得到中温α-淀粉酶基因(amy L)并构建了重组表达质粒p AX01-amy L。该质粒转化枯草芽孢杆菌264后利用同源重组机制将由木糖操纵子引导的amy L表达盒整合入枯草芽孢杆菌染色体的lac A位点,以增加中温α-淀粉酶基因的拷贝数。经淀粉平板产酶初筛及Southern blot鉴定,成功分离获得了可高效分泌表达中温α-淀粉酶的基因工程菌ZHWY。该菌株在摇瓶发酵75 h后α-淀粉酶酶活可达到730 U/m L,比酶活为156 U/mg总蛋白,与原始菌株264相比提高了70%,且继代过程中表达水平稳定。在5 L发酵罐中,枯草芽孢杆菌ZHWY发酵所产中温α-淀粉酶酶活最高达到1450 U/m L,具有良好的工业应用前景。     

基因重组型枯草芽孢杆菌芽孢表面展示技术与应用

枯草芽孢杆菌是一种好氧型革兰氏阳性益生菌,在营养匮乏的环境下,可形成具有强抗逆性的芽孢。其芽孢独特的结构和生理功能使得芽孢表面展示技术相较于其他表面展示技术具有多种优势,构建的重组芽孢不但易纯化、回收率高,而且安全性好。近年来,枯草芽孢杆菌芽孢表面展示技术得到迅猛发展,已成功利用CotB、CotC、CotG、CotZ、CotA、OxdD、CotE、CotZ、CgeA等多种锚定蛋白将外源蛋白或多肽展示在芽孢表面,并应用于工业化酶、口服疫苗和药物、大分子量多聚体蛋白的生产以及环境污染的生物治理等领域。本文首先介绍了芽孢展示系统整合策略,并重点阐述了基因重组型枯草芽孢杆菌芽孢展示技术中涉及的锚定蛋白以及该技术在各领域的应用与展望。     

枯草芽孢杆菌发酵鱼粉产蛋白酶及其酶解效果

为开发以鱼粉为原料的优质饲料蛋白源以及相关保健食品,开展了用不同鱼粉为氮源发酵枯草芽孢杆菌生产蛋白酶及其酶解效果的研究,比较了不同菌种的发酵效果,确定了最佳发酵时间.通过蛋白酶活性测定和氨基态氮含量测定分析了不同菌种的产酶能力和酶活性大小及其酶解效果.结果表明,用罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵商业化的工业菌种枯草芽孢杆菌产生的酶活性显著高于鲢鱼鱼粉(P<0.05),发酵后上清液中的氨基态氮含量也显著高于鲢鱼鱼粉(P<0.05),即工业化的枯草芽孢杆菌对不同鱼粉的发酵效果不同,罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵效果显著优于鲢鱼鱼粉.     

高产不同分子量透明质酸工程菌株的构建

透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种高分子糖胺聚糖,其生理功能与其分子量大小密切相关,可广泛应用于眼科学、整形手术和化妆品等领域.目前,工业上普遍利用遗传背景清楚且是公认安全菌株(如枯草芽孢杆菌等)生产HA.通过导入外源透明质酸合酶基因hasA并共表达HA合成途径相关基因,得到一株生产HA的枯草芽孢杆菌.构建的菌株在不同温度下产生不同分子量和产量的HA,其中在32 ℃条件下培养获得的HA分子量最低,为0.392 MDa,其产量可达到3.65 g/L;在47 ℃条件下培养获得的HA分子量最高,为6.937 MDa,但其产量仅为1.72 g/L.本研究提供了一种新的策略来实现不同分子量透明质酸的生产.     

枯草芽孢杆菌培养液水解鱼蛋白质制备蛋白胨的初步研究

对枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶的产生条件及其培养液水解鱼蛋白质制备蛋白胨进行了初步研究．结果表明，适宜枯草芽孢杆菌产蛋白酶的培养基初始pH值7．0、培养温度30℃、250mL三角瓶中的装液量为60mL，培养时间为24h；用枯草芽孢杆菌培养液为蛋白酶源水解蛋白质时，应控制反应体系的温度为55℃，pH9．0，加入低浓度的Mg^2＋、Ca^2＋并去除Cu^2＋、Fe^3＋、Pb^2＋和Ag^＋，对枯草芽孢杆菌产酶有促进作用．用枯草芽孢杆菌培养液分别水解鳕鱼粉和罗非鱼，蛋白质制备蛋白胨的得率分别为13．95％和14．96％，与目前的工业水平基本相当．     

成孢延迟蛋白基因对枯草芽孢杆菌生物量和发酵酶活力的影响

探讨同种相噬对枯草芽孢杆菌内源酶发酵活力的影响.应用同源重组敲除的方法,构建了枯草芽孢杆菌168菌株的编码成孢延迟蛋白毒素前体的基因sdp C的knock-in突变株,比较了突变株和出发菌株的生物量、芽孢数和α-淀粉酶发酵活力.与出发菌株相比,突变株的生物量、芽孢数和α-淀粉酶发酵活力均显著提高,产酶高峰期酶活力提高23%.本研究结果显示,sdp基因突变不仅能够提高枯草芽孢杆菌的生物量,还能够提高其内源酶的发酵活力.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子的研究进展

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是工业应用中一种重要的模式菌株,具有非致病性、遗传背景清晰、分泌蛋白能力强、容易分离培养等特性,是异源蛋白表达和分泌的理想宿主。高效可控的启动子是实现外源蛋白高效表达的关键因素之一。根据诱导机制,启动子可分为组成型启动子、诱导型启动子、自诱导启动子和时期特异性启动子。本文介绍了枯草芽孢杆菌表达系统、芽孢杆菌σ因子类型及枯草芽孢杆菌启动子的结构,比较了常用启动子的优缺点,总结了新启动子克隆和改造及生物信息学预测启动子的方法,并对枯草芽孢杆菌启动子未来的研究方向进行展望,为进一步研究启动子的结构和功能及工业生产外源蛋白奠定基础。     

枯草杆菌纤溶酶基因的克隆及表达

为了提高豆豉纤溶酶(DFE)的表达产量,采用PCR方法从高纤溶活性的枯草芽孢杆菌DC12的基因组中扩增获得DFE基因,将含有启动子至3非翻译区的全长1400 bp基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3,构建了DFE基因的表达质粒,化学转化枯草杆菌WB800获得了DFE的重组表达菌.试验结果表明:DFE基因在自身启动子驱动下,在蛋白酶缺陷型的枯草杆菌中获得了高活性的分泌表达;重组表达菌株培养30 h后,培养物上清液中的纤溶酶活性最高可达690U/mL.     

枯草芽孢杆菌对早熟禾和紫花苜蓿修复镉污染土壤的强化作用

植物-微生物联合修复是一种经济可行且生态良好的重金属污染土壤修复方法.通过盆栽试验,探究接种枯草芽孢杆菌对两种草坪植物(早熟禾、紫花苜蓿)去除土壤中镉效率的影响及机制.结果表明,种植早熟禾时,枯草芽孢杆菌能够阻隔早熟禾吸收镉,显著提高生物量,增加土壤酶活性,降低土壤有效态镉含量,并且将土壤中总镉的去除率提高约49％;对于紫花苜蓿,枯草芽孢杆菌能够促进紫花苜蓿吸收镉,显著提高生物量,增加土壤酶活性、微生物物种多样性以及有效态镉含量,并且将土壤中总镉去除率提高约140％.可见,接种枯草芽孢杆菌对两种草坪植物修复镉污染土壤均表现出显著的强化作用,而且能够改善只种植紫花苜蓿造成的土壤微生态环境破坏.研究接种枯草芽孢杆菌对两种草坪植物不同的影响和强化机制将为重金属污染场地的植物-微生物修复策略的制订与实施提供理论支持.     

葡甘聚糖酶高产菌株Bacillus subtilis的超剂量诱变育种

超剂量诱变育种就是加大诱变剂处理剂量,提高菌株突变幅度,从而获得较好的诱变效果.以葡甘聚糖酶产生菌Bacillus subtilis MY-1为初始菌株,先用紫外线、硫酸二乙酯进行单因子诱变,再用超剂量复合诱变,经过透明圈法和摇瓶筛选,得到了一株高产葡甘聚糖酶的突变菌株,命名为Bacillus subtilis UDMY-25,连续传代培养5次,发酵酶活稳定在5 387.2U/mL以上,较原初始菌株提高了44.8%,该菌株产酶能力处于同领域较高水平,具有较好的开发潜力和市场应用价值.     

腺苷生产菌株的回复突变和性质检验

腺苷具有重要的医学价值,由RNA降解获取腺苷成本极高,用微生物发酵法生产腺苷具有重大的经济意义.作为腺苷的生产菌株,黄嘌呤缺陷型的枯草芽孢杆菌如果在生产过程中发生回复突变将会降低腺苷产量.本实验研究了枯草杆菌的黄嘌呤缺陷性菌株是否会回复突变、以及突变菌株的各种性质,进行了V.P.,硝酸盐,高盐浓度,淀粉水解检验,以及进一步的IMP脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、腺苷脱氨酶的活性分析,发现大量菌株发生回复突变,该缺陷型菌株遗传非常不稳定,这些突变菌株与生产菌株相比,IMP脱氢酶活发生显著变化,黄嘌呤氧化酶与腺苷脱氨酶的活力没有明显变化.     

水解胶原蛋白对枯草芽胞杆菌生长的影响

本文测定了不同氮源(水解胶原蛋白CH、蛋白胨、明胶、硝酸钠、氯化铵)对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)生长的影响;考察了CH和玉米浆的不同配比对枯草芽胞杆菌生长的影响;研究以CH为氮源时,不同碳源对枯草芽胞杆菌生长的影响;考查CH对其它细菌发酵的影响.研究发现,在CH为氮源条件下,枯草芽胞杆菌的发酵过程可顺利进行,且微生物的生物量可保持在较高水平;同玉米浆相比,CH能使枯草芽胞杆菌达到较高的生物量;以CH为氮源时,淀粉比葡萄糖、蔗糖更有利于枯草芽胞杆菌的生长;除了枯草芽胞杆菌以外,大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 15489)和地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis CICC 20031)也能有效利用CH.这表明,在实验条件下水解胶原蛋白(CH)可以作为多种微生物发酵的氮源.     

产中性蛋白酶工程菌的构建及其发酵条件的初步优化

为构建1株产中性蛋白酶的工程菌株并对其发酵条件进行优化,以中性蛋白酶工业生产菌株枯草芽孢杆菌AS1.398的基因组为模板,采用PCR技术扩增获得中性蛋白酶基因npr,与高拷贝质粒pWB980连接并转入蛋白酶缺陷型菌株枯草芽孢杆菌WB600中得到重组工程菌WB600/pWB980-npr.在初筛平板上工程菌蛋白酶活力明显高于工业生产菌AS1.398,工程菌发酵活力可达1,398.3,U/mL.通过对其发酵工艺进一步优化,在接种量5%、装液量100,mL/500,mL、摇床转速180,r/min、温度34,℃的条件下发酵48,h,发酵液的酶活力可达2,487.5,U/mL,比优化前提高了78%.     

枯草芽孢杆菌的ade基因在大肠杆菌中的MBP融合表达及活性鉴定

扩增了枯草芽孢杆菌的ade基因, 重组入载体pMal-c2x中, 构建了麦芽糖结合蛋白（MBP）融合蛋白的表达体系. 通过IPTG诱导表达, 用MBP亲和层析法, 纯化该融合蛋白（104 700）, 并通过SDS-PAGE对表达及纯化结果进行检验, 对其酶学性质进行了初步研 究. 分析结果表明: 该融合酶蛋白具有显著的腺嘌呤脱氨酶活性, 证明了ade基因是枯草芽孢杆菌中编码腺嘌呤脱氨酶的基因.     

内生枯草芽孢杆菌HD-1β-甘露聚糖酶基因的克隆及结构生物学分析

采用PCR技术从一株内生枯草芽孢杆菌HD-1基因组DNA中扩增出β-甘露聚糖酶基因核苷酸编码序列.序列分析表明,该基因全长1 089bp,编码362个氨基酸和一个终止密码子,N端前27个氨基酸为其信号肽.该酶氨基酸序列与相同来源的β-甘露糖苷酶同源性最高达98.34%,具有ManB保守结构域,属于糖苷水解酶家族26的一员.通过对该酶分子三维结构的预测分析,该酶的催化域形成TIM桶状结构,Cys92和Cys112形成二硫键,它们之间的部分构成该酶的氧化还原反应的活性中心,Glu100和Glu292分别为该酶的酸碱催化位点和亲核催化位点.三维结构的分析为提高酶的催化活性的和功能方面的定向改造提供了依据.     

一株高温菌所产酶的功能分析与菌株分类鉴定

从长白山温泉中分离出一株可产生淀粉降解酶的高温菌(CW₂)， 用薄层层析法分析鉴定酶促淀粉降解的产物， 发现CW₂所产生的淀粉降解酶系胞外酶， 可催化淀粉降解产生异麦芽低聚糖(主要包括异麦芽糖、 异麦芽三糖和潘糖). 用PCR法扩增其16S rDNA， 测定其序列（873 bp）， 与GeneBank中已知菌的16S rDNA序列对 比， 该菌株与模式菌株Bacillus licheniformis ATCC 14580，Bacillus licheniformis  DSM 13,Bacillus subtilis strain JM4的16S rDNA序列同源性最高， 只分别相差9,9,13个碱基， 序列相似性分别为98.97％,98.97％,98.51％. 用Neighbor joining方法构建CW₂进化树， 并用Bootstraping法对其评估， 结果表明， CW₂与Bacillus licheniformis， Bacillus sonorensiss形成Bacillus属中的亲缘关系最近的一个进化种群.