朱黄青霉α-葡聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达

【目的】提高朱黄青霉（Penicillium minioluteum ）α-葡聚糖酶（Dextranase）基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达水平。【方法】根据毕赤酵母的密码子偏爱对酶基因进行优化与合成。优化后的基因片段与载体 pGAPZαA 连接,转化毕赤酵母 KM71 H。【结果】获得组成型分泌表达α-葡聚糖酶的工程菌 KM71 H／pGAPZαA-dex。发酵工艺试验中,摇瓶培养144 h,酶活为153 U／mL。6．8 L发酵罐补料分批培养92 h,酶活达到1218 U／mL。【结论】该工程菌以甘油作为碳源,发酵调控简单,产酶水平较高,具有适用于大规模生产的潜力。     

红色荧光蛋白在毕赤酵母中的高效表达

报道了红色荧光蛋白(DsRFP)在毕赤酵母中的高水平表达．利用PCR技术从YEpFLAG-1-DsRFP扩增出DsRFP编码序列．克隆到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3．5K构建重组表达载体pPIC3．5K-DsRFP．电击转化进毕赤酵母．G418-RDB平板双重筛选后获得重组转化子．经MM／MD平板培养与PCR鉴定．重组子全部为HIS^ -MUT^ 表型．重组菌株诱导表达48h后获得了高效表达．摇瓶中表达水平达到细胞内总蛋白的12％．表达量达到1．8g／L．经硫酸铵分级沉淀，DE-AE-5PW阴离子交换柱层析与S-HyperD阳离子交换柱层析后获得电泳纯蛋白．说明我们建立的毕赤酵母表达应用平台具有高效表达外源蛋白的能力。     

重组人粒细胞集落刺激因子的摇瓶发酵研究

目的 优化重组大肠杆菌生产人粒细胞集落刺激因子摇瓶发酵工艺条件。方法 利用摇瓶系统地考查rhG-CSF茵株培养温度、诱导时机、pH值、溶氧、种子茵龄、接种量等工艺条件，选择出最佳的摇瓶培养条件。结果 最佳条件为：培养温度30℃；初始pH值在7．0～7．2；装液量20％；摇床转速180r／min；种子菌龄在A600为1．0～1．5时接种，并在对数生长前期(A600=1．0)时诱导4h。在此优化的培养条件下，在摇瓶中使用优化后的M9培养基时，rhG-CSF的表达量占茵体总蛋白的36．5％，光密度达5．85。结论 构建的rhG-CSF工程菌发酵的稳定性和重复性良好，可作为rhp-CSF的大规模生产提供可靠的放大依据。     

重组鸡IL-18与新城疫HN基因融合蛋白在毕赤酵母中表达条件的优化

为探索ChMIL18-HN在毕赤酵母中最适宜的表达条件,采用小型摇瓶培养系统,通过对重组毕赤酵母菌X-33/pPICZαA-ChMIL18-HN在不同诱导时间、培养液pH值、甲醇诱导剂剂量及培养温度的条件下表达目的蛋白的分析,以对其表达条件进行优化。结果表明:重组菌X-33/pPICZαA-ChMIL18-HN在pH6.5,甲醇诱导浓度为1.5%,培养诱导温度为30℃的条件下诱导156h,目的蛋白的表达量最高。     

猪IFNα在毕赤酵母中分泌表达条件的优化及高密度发酵

从发酵时间、接种量、pH值、诱导剂量等方面对重组基因工程（毕赤酵母甲醇利用缓慢型）的摇瓶发酵条件进行了优化，进一步探索了酵母菌表达猪IFNα的发酵工艺，包括种细胞密度对初始发酵期的影响，补加甘油、甲醇速率条件的控制等．结果表明，摇瓶发酵时，诱导最佳时间为96h，甲醇最适浓度为8g/L，发酵pH范围为6.4～9．0．最适接种量2：1．在分批发酵、接种量为10%且种子细胞光密度（OD600）为5～6时，最有利于细胞的高密度培养，在补料发酵时，根据溶氧控制甘油流加速率与时机，细胞干重达到118．75g／L，在48h重组猪IFNα表达量达到1。304g／L．     

植酸酶工程菌产酶条件优化研究

为研究影响植酸酶酵母工程菌的产酶因素，利用摇瓶发酵对毕赤酵母工程菌产植酸酶的最佳甲醇诱导量、诱导时间等因素进行实验分析。结果显示，残留甘油、甲醇浓度、诱导培养时间对植酸酶生产具有重要影响，其中甘油残留会使植酸酶分泌时间延迟，1.5% 甲醇具有最佳诱导效果，在第2天酶活可以达到约1 100 U/mL，低浓度甲醇诱导产酶缓慢积累，而高浓度甲醇对菌体产生毒害。该研究为进一步优化植酸酶工程菌高密度发酵工艺奠定了基础。     

人Cu，Zn-SOD在重组毕赤酵母中表达的发酵工艺研究

以表达人Cu,Zn-SOD的重组毕赤酵母为出发菌株,通过摇瓶实验研究发酵初始pH值、诱导剂浓度、诱导温度和培养基组成等因素对目的蛋白表达水平的影响.实验结果表明,培养基组分对目的蛋白表达水平的影响最大.与YPG培养基相比,菌株在FM22培养基(含0.15%组氨酸及PTM4)中目的蛋白表达量提高5.5倍.在优化摇瓶发酵条件下(诱导剂浓度1%,诱导温度27℃,FM22培养基(含0.15%组氨酸及PTM4),初始pH值为6.0),发酵液上清酶活水平为895 U/mL,较初始提高8.5倍;以摇瓶实验结果指导5 L罐发酵,得到13 539 U/mL酶活,为摇瓶试验的15倍.     

鲨鱼软骨活性段蛋白在大肠杆菌中的融合表达及培养条件的优化

采用三角摇瓶来摸索菌种BL21（DE3）/pET3C-aSCAIF表达目的蛋白的最优发酵条件,并在此基础上在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中,利用补料分批培养技术,流加甘油,进行发酵培养.摇瓶培养最优条件：2%接种量、25 mL LB培养基、37℃培养、0.5%的甘油做碳源,接种后4 h加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导4 h后目的蛋白表达量最高.菌种在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中的条件为：以10%的接种量接种到2.5 L发酵培养基中,设定溶氧30%,pH7.0,温度37℃,通气量3 L/min,流加甘油15 g,培养4 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导4 h后终止发酵,发酵罐中获得的菌体量为62.1 g.     

猴头菌深层发酵工艺条件的研究

通过单因子试验和多因子正交试验，优化筛选了适于猴头茵摇瓶培养条件。结果表明，其适宜的摇瓶条件为：培养温度28℃，培养基起始pH值为5．0，摇瓶装量为60mL／250mL，接种量15％，摇瓶培养最适碳氮源及其浓度分别为：可溶性淀粉3．5％。酵母膏3．5％。     

HAC1基因过表达对重组人CTLA-4蛋白在毕赤酵母中分泌表达的影响

重组人细胞毒性T细胞相关抗原(Cytotoxic T Lymphocyte Associated Antigen 4,CTLA-4)是一类重要的基因工程药物,其在毕赤酵母中表达水平偏低使其一直无法广泛应用于临床治疗.而影响毕赤酵母中的外源蛋白分泌表达的因素,主要为内质网中的折叠速率以及不可折叠蛋白积累造成的胞内胁迫压力.本文通过在毕赤酵母细胞中过表达HAC1基因对毕赤酵母细胞中未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR)的信号通路进行调控,从而改善了CTLA-4蛋白的表达水平.摇瓶中改造菌株M-HAC1发酵上清液中该蛋白的分泌表达量是原始菌株表达量的2.55倍.     

关于不定方程x~2+y~2+z~2=2w~2的解的研究

对不定式x~2+y~2+z~2=2w~2的非零整数解进行变换,找到了变换矩阵,并通过变换矩阵和若干个易求出的解,得到了该方程的若干组解。进而求出了一个古典刁番都方程组的若干组正整数解。     

关于Pell方程x2-2y2=1和y2-Dz2=4的公解

证明了若D =2 ∏si=1pi,pi 为互异的奇素数 ,且pi ≡ 5 (mod 8)或pi ≡ 7(mod 8)时 ,Pell方程x2 - 2y2 =1和y2 -Dz2 =4仅有平凡解z=0     

关于一类Pell方程的公解

证明了如果1≤l≤3,D＝Лlj=1qjЛsj=1pi,其中,qj和pi为互异的奇素数,而且qj≡3（mod8),pi≡5(mod8)或pi≡7（8),mj Pell方程x2-2y2=1主y2-Dz2=4仅有平凡解z=0。Л     

也谈不定方程组x2-2y2=1,y2-Dz2=4

设D=2k∏i=1pil∏j=1qj，其中，诸pi和qj是互异的奇素数，pi≡5或7（mod8),qi≡3(mod8），l≤3。本文证明了不定方程组x^2-2y^2=1，y^2-Dy^2=4仅有平凡解z=0。     

LiCl-BaCl_2-SrCl三元熔盐系相图的研究

用差热分析法研究了Licl-Bacl_2-Srcl_2三元系及三个侧边二元系的相图。研究表明Licl-Bacl_2和Licl-Srcl_2二元系是两个低共晶体系,其共晶点E_1和E_2对应的温度分别为526℃和489℃。Bacl_2-Srcl_2二元系是具有最低温度点的连续固溶体。Licl-Bacl_2-Srcl_2三元相图中通过E_1和E_2及温度最低点E的二次析出线将三元系分为两个一次结晶面:Licl的一次结晶面和Bacl_2-Srcl_2固溶体的一次结晶面。该三元系的最低熔化温度是482℃,仅略低于Licl-Srcl_2二元系的共晶温度;三元系温度最低点E的组成为58.4mol％Licl,15.8mol％Bacl_2和25.8mol％Srcl_2。     

2—旋转矩阵及其性质

通过研究矩阵A与其2－旋转矩阵A‘之间的关系,得到A‘的较为完整的一第列性质。     

长效H2受体拮抗剂-拉呋替丁的合成

以2-溴-4-(哌啶基甲基)吡啶为原料,与2-丁烯-1,4-二醇醚化,经氯化、G abrie l反应、肼解,然后再与2-呋喃甲硫基-S-氧代乙酸对硝基苯酚酯进行胺解反应,制得第二代长效H2受体拮抗剂拉呋替丁,总收率为29.89%[以2-溴-4-(哌啶基甲基)吡啶计]。     

缺项算子矩阵的左谱

设A∈B(ye),B∈B(k),C∈(B)((k),(ye))给定,对X∈B((ye),(k))定义Mx=(AXCB)ye( )k→ye( )(k).在一定条件下刻画集合∩X∈B((k),(ye))σl(Mx)和∩X∈B((k),(ye))σl(Mx),其中σl(T)和σr(T)分别表示算子T的左谱和右谱.利用了算子矩阵的分块技巧和算子分块的几何结构.在C是闭值域的条件下,完全刻画了∩X∈B((k),(ye))σl(Mx)和∩X∈B((k),(ye))σl(Mx).此刻画在缺项算子矩阵的谱的研究中是新的结果,应用该刻画可以得到若干已知结论.     

ZnC2O4·2H2O-NiC2O4·2H2O在空气中的热分解动力学

通过热重法(TG-DTG)、差示扫描量热法(DSC)、X射线衍射(XRD)技术研究了固态物质ZnC2O4·2H2O-NiC2O4·2H2O机械混合物(摩尔比3:2)在空气中热分解的过程.TG-DTG的曲线表明:其热分解过程TG曲线中4个明显的台阶与理论失重相吻合.XRD结果表明:样品在500℃煅烧生成为较好晶型的ZnO-NiO混合物.用Kissinger-Akahira-Sunose(KAS)法和Ozawa法求取Ea,用热分析动力学三因子求算的比较法判断出可能的机理函数.ZnC2O4和NiC2O4热分解的活化能分别为175.69～176.48 kJ/mol、220.28～200.93 kJ/mol,ZnC 2O4和NiC2O4分解反应过程可能遵循的机理函数微分形式分别为f(α)=3(1-α)[-ln(1-α)]2/3和f(α)=2(1-α)[-ln(1-α)]1/2;积分形式分别为g(α)=[-In(1-α)]1/3和g(α)=[-ln(1-α)]1/2,都属于随机成核和随后生长型机理函数(Avrami-Erofeer),Am,其调节因子m=3、2.     

特征2李代数G2的生成元

利用特征2代数闭域上G2嵌入Gartan型李代数K(5)结果,给出特征2李代数G2的齐次生成元集,从而证明特征2李代数G2可以由两个元素生成.