Molecular cloning and expression of Pfu DNA polymerase gene and its application in long-distance PCR

A 2.3 kb DNA fragment containing Pfu DNA polA gene was amplified by PCR from total DNA of Pyrococcus furiosus and cloned into a pGEM-T vector. The recombinant clone pT-pfu was digested with Nco I and Xho I and the fragment was inserted into an expression vector pET3d-X. The Pfu polA gene was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The gene product (Pfu) was purified with heat denaturation, polyethylenemine (PEI) precipitation and Bio-rex 70 ion-exchange chromatography. The recombinant Pfu was verified by protein N-terminal sequencing. With the recombinant Pfu, large λ DNA fragments were successfully amplified in long-distance PCR.     

国内期刊亮点

正乙酸钙不动杆菌磷脂酶C在大肠杆菌中重组表达、纯化及酶学性质江南大学汪艳红等以A.calcoaceticus ATCC17902基因组DNA为模板,PCR扩增得到2段磷脂酶C基因(PLC1、PLC2),构建重组大肠杆菌表达质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,实现PLC1、PLC2基因的表达。IPTG诱导表达后,经镍柱亲和层析纯化重组蛋白。成功构建2株产磷脂酶C的重组大肠杆菌并纯化,样品经SDS-PAGE分析在80 k Da附近均出现显著的特异性条带。得到了酶的活性、最适温度、最适p H的等酶     

牦牛病毒性腹泻病毒P20和P14蛋白基因的原核表达及其产物检测

以牦牛BVDV基因组DNA为模板, 运用聚合酶链反应首次成功扩增出牦牛BVDV P20及P14基因, 并将其插入到pET-28a原核表达载体, 构建重组表达质粒pET-28a-P20和pET-28a-P14并分别转化至Rosetta(DE3)和BL21(DE3) 宿主菌中, IPTG诱导表达, 经SDS-PAGE检测, pET-28a-P20在宿主菌Rosetta(DE3)和BL21(DE3)中表达出约26KU的融合蛋白, pET-28a-P14表达出约20KU的融合蛋白, 结果分析表明p20和p14蛋白在两个宿主中都获得了高效表达, 表达出的蛋白大小与预期结果相符.     

海南斑等蝎钾通道阻断剂Im58的克隆、表达、纯化和鉴定

为表达钾离子通道阻断剂Im58,设计了4条搭桥PCR引物,通过overlap PCR的方法扩增出蝎毒肽Im58DNA全长片段,选用表达载体pGEX-4T-1,将测序正确的克隆转化至大肠杆菌E.coli/Rosetta(DE3)中.通过检测不同诱导时间和IPTG浓度下融合蛋白的表达量,筛选出最优表达条件.表达蛋白经IPTG诱导后,融合蛋白再经GSH亲和层析柱纯化,将洗脱液经超滤浓缩脱盐、纯化后得GST-Im58融合蛋白,蛋白用小肠激酶酶切后通过RP-HPLC C18柱分离获得色谱纯的蝎毒肽.蝎毒肽通过Tricine系统的SDS-PAGE蛋白质电泳鉴定重组多肽的分子量大小和纯度,并由MALDI-TOF-MS来精确测定重组多肽的分子量.结果表明:Im58阳性克隆子证明成功构建了Im58原核表达载体,Tricine系统的SDS-PAGE蛋白质电泳和MALDI-TOF-MS鉴定Im58多肽表达纯化成功.     

重组大肠杆菌产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的培养基优化

为了提高重组大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)-pET-22-bgl-(kil-Km)的产酶能力,采用单因素试验研究了培养基碳源、氮源及碳氮比(摩尔比)对重组大肠杆菌Rosetta(DE3)-pET-22-bgl-(kil-Km)分泌表达重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶H(A107-M)的影响.在此基础上,采用Box-Behnken设计法和响应面分析法对以上影响因素进行优化,得出最优培养基成分为(g/L):甘油10.01,酪蛋白胨12.03,酵母粉24,NaCl 10,(NH4)2SO44.77,KH2PO42.31,K2HPO412.54.在     

Catalase-TAT的融合表达与表征

利用RT-PCR技术从人的肝细胞中克隆出成熟蛋白过氧化氢酶(catalase)的基因,通过PCR将其与TAT基因融合形成融合基因(catalase-TAT);将catalase-TAT基因构建到表达质粒pET21a(+)中,转入大肠杆菌Rosetta2(DE3);通过IPTG诱导,转化子成功表达出catalase-TAT融合蛋白.重组菌发酵菌体破碎液经过硫酸铵沉降和Sp-5pw阳离子交换色谱,分离得到电泳纯的目的蛋白,其纯化倍数为18.51倍;经理化性质分析确定了此融合蛋白的最适pH和温度稳定性;细胞实验表明融合蛋白catalase-TAT能够明显提高胞内的过氧化氢酶活性.     

小鼠酪氨酸酶的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT -PCR)方法,从小鼠黑色素瘤总RNA中扩增得到小鼠酪氨酸酶的cDNA .该基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET - 2 2b(+)中,构建表达质粒pET -TYR并转化大肠杆菌Rosetta (DE3) .SDS -PAGE及蛋白质序列测定表明,经0 .8mmol/L异丙基硫代- β-D -半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组的小鼠酪氨酸酶,表达量约占菌体总蛋白质的2 5 % ,表达产物为包涵体     

δ-氨基-γ-酮戊酸合成酶(ALAS)基因的克隆与原核表达

为获得ALAS的重组表达蛋白,以人肝脏组织cDNA为模板,通过PCR扩增得到ALAS全长片段并测序,成功构建了pET30a(+)-ALAS融合表达载体并转化大肠杆菌Rosetta(DE).IPTG诱导融合蛋白表达.SDS变性凝胶电泳结果显示,融合蛋白的分子量约70kDa,并且在上清液中有少量表达.经镍柱一步纯化得到His6-ALAS融合蛋白.     

大肠杆菌植酸酶appA的融合表达及耐热性研究

提取大肠杆菌(SUGL)基因组DNA,通过PCR方法从基因组扩增得到植酸酶基因ap-pA,测序结果表明该基因的ORF读框包含1440个核苷酸.将该基因重组于大肠杆菌表达载体pET-32a(+)中,导入大肠杆菌BL21(DE3),构建工程菌BL21(DE3)-pET32a-appA.对表达条件进行了优化,在30℃下,以0.1mmol/L IPTG诱导表达植酸酶,表达量达到10%以上.在37℃,用钒钼酸铵法测定了表达的植酸酶活性为40740.7U/g,同时观察不同加热温度对植酸酶活性的影响程度.发现融合表达的     

凋亡素融合蛋白的基因克隆、表达与体外活性分析

来源于HIV-1病毒(47~57位氨基酸)的TAT小肽具有跨膜功能,可以将外源蛋白进行跨膜转运。通过聚合酶链反应(PCR)的方法扩增了TAT-凋亡蛋白序列,与载体pET-28b连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高表达,以包涵体形式表达的TAT-凋亡蛋白在变性条件下进行了Ni-NTA纯化,纯化的蛋白经MTT法证明具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的克隆和表达

为了更好地研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的结构和功能,采用PCR(聚合酶链式反应)、双酶切和细胞转化等基因工程方法对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因进行克隆并使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表达分析,扩增出一个新的大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因,将其基因克隆到原核表达载体pET-30a上,并导入到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。通过IPTG诱导成功表达出大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。所提出的方法能够高效表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,为进一步大规模表达纯化和应用提供参考。     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的表达和纯化

将人胰岛素原基因序列(human proinsulin, PI)经密码子优化后与TrxA蛋白融合表达,构建原核表达载体TrxA-PI转入不同大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、TransB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)中。SDS-PAGE显示融合蛋白在3种表达菌株中均有表达,在Rosetta-gami(DE3)中表达量最高,是普通大肠杆菌BL21(DE3)表达量的10倍。通过优化诱导温度等发酵条件,可溶性重组融合蛋白TrxA-PI在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达量为3.5 g/L,比未优化时提高约10倍。TrxA-PI用肠激酶酶切后,利用HisTrap FF柱分离纯化PI,经Western-blot检测重组PI具有免疫原性。     

G蛋白偶联受体激酶5在大肠杆菌中的表达纯化

通过RT-PCR扩增得到了人G蛋白偶联受体激酶5(GProtein-coupledreceptorki-nase,GPK5)的基因,将其克隆到表达载体pET-28a中,并将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),在10μmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPIG)诱导培养下表达,通过分离纯化,得到部分纯化的GRK5蛋白。体外活性测定表明,纯化后的GPK5能够特异性地磷酸化视紫红质。动力学常数Km=4.3μmol/L,Vmax=25nmol/(mg·min),与文献报道的从真核表达系统中纯化得到的GRK5相近。     

人超氧化物歧化酶-过氧化氢酶融合基因的构建、表达及其产物的初步纯化和性质研究

尝试应用基因工程技术制备一种兼具人超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的双功能融合蛋白CAT-PTD-SOD,其中的PTD是序列为RKKRRQRRR的短肽.首先通过重叠PCR构筑CAT-PTD-SOD融合基因,然后把该基因转化进入大肠杆菌表达菌株Rosetta 2(DE3)菌株.通过SDS-PAGE、CAT和SOD活性分析以及分离纯化组分的分析确认该重组菌株能够表达CAT-PTD-SOD,其表达量可达总蛋白的8.9%,SDS-PAGE显示其分子量约为85 kD.可溶性实验发现该融合蛋白大部分以兼具SOD和CAT活性的可溶形式存在.抗H2O2能力实验表明CAT-PTD-SOD具有很好的抗H2O2能力,在0.033 mol.L-1、甚至0.067 mol.L-1的H2O2溶液中,其SOD活性20 min内无明显下降.     

AtbZIP19和AtbZIP23蛋白的原核表达

bZIP类转录因子参与调控多种生物学过程,包括植物生长、花的发育、种子的成熟、衰老、光信号传导、损伤修复、病菌防御以及对各种环境胁迫的响应等。文章构建AtbZIP19和AtbZIP23基因的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了蛋白表达;提取拟南芥植株总RNA,通过RT-PCR克隆AtbZIP19与AtbZIP23基因cDNA全长;将pET-32a+载体和聚合酶链反应(PCR)产物进行双酶切,通过DNA连接反应将2个基因定向克隆到pET-32a+质粒中;经菌液PCR和测序鉴定获得阳性克隆后,将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达得到目的蛋白。     

DNA结合蛋白DbpA影响DNA聚合酶性能的研究

DNA聚合酶是催化DNA合成的酶,在体内和体外都具有重要的作用.在体内DNA聚合酶参与DNA的复制、损伤修复等,在体外DNA聚合酶是现代分子生物学重要的工具酶.Pfu DNA聚合酶因具有高保真性而被广泛使用,但延伸速度慢,提高其延伸速度将使其应用更加广泛.DbpA是古生菌Sulfolobus solfataricus细胞内含量丰富的非特异性双链DNA结合蛋白,分子质量8ku.本研究通过引物重叠延伸的方法得到密码子优化的DbpA基因,并构建得到Pfu-DbpA基因.结果表明:融合有DbpA蛋白的Pfu DNA聚合酶(Pfu-DbpA DNA聚合酶)自身的热稳定性不受影响,而延伸速度得到了提高;同时具有更高的耐盐性,说明具有更高的持续合成能力,并且能够适应更广泛的缓冲液体系.应用Pfu-DbpA DNA聚合酶扩增λDNA不同长度的片段,结果显示其比Pfu DNA聚合酶具有更好的应用效果.     

异戊二烯焦磷酸异构酶的表达及其催化功能验证

以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,采用聚合酶链式反应扩增法分别克隆来自大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶基因,将其在大肠杆菌BL21(DE3)中异源过量表达,验证其催化功能,并考察其对β-胡萝卜素和异戊二烯合成的影响。结果表明,来自枯草芽孢杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶对β-胡萝卜素和异戊二烯的产量有明显的促进作用,该酶的异源表达使β-胡萝卜素的产量由1.08mg/L提高到3.25mg/L,异戊二烯的产量由0.80mg/L提高到2.96mg/L。     

人表皮生长因子融合蛋白在大肠杆菌表达的研究

在大肠杆菌中高效表达人表皮生长因子(hEGF)。根据大肠杆菌对密码的偏爱性,构建高效表达EGF融合蛋白的菌株,经离子交换层析和凝胶过滤层析两个步骤使产物得到纯化。融合蛋白表达产量为27%,EGF融合蛋白纯化产物纯度为95%以上,促3T3细胞增殖的活性测定为ED50为4.2ng/mL。在pET 3c:BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中,以融合蛋白方式表达人表皮生长因子,表达效率高,纯化路线简单,产量较高,适合产业化生产。     

人类线粒体转录因子B1和B2与裂殖酵母线粒体转录聚合酶Rpo41相互作用的初步研究

由L02型人肝脏细胞cDNA通过PCR技术获取到线粒体转录因子B1和B2的ORF片段(NM_022366和NM_016020);构建表达质粒pGEX-4t-1/GST-mtTFB1及pMAL-c-2X/MBP-mtTFB2,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经亲和层析,分子筛和阳离子交换柱得到纯度较高的蛋白.利用体外pull-down实验证实TFB1和TFB2均与来源于裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的线粒体RNA聚合酶(Rpo41)存在分子间相互作用.在裂殖酵母中过表达h-TFB1和h-TFB2,利用实时荧光定量PCR检测,2个蛋白在酵母体内均对线粒体基因转录产生影响.     

抗栓肽和尿激酶原（B链）嵌合体的构建与表达

通过基因工程重组技术,将抗栓肽（decorsin）基因与尿激酶的B链即scu-PA(B)基因用柔性Linker((Gly₄Ser)₃)融合在一起,构建新的嵌合体基因dscuPA(B),在大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中通过IPTG诱导表达, 并考察了重组质粒在Rosetta(DE3)plysS在传代中的分离稳定性。该融合蛋白在大肠杆菌中是以包涵体的形式存在,对包涵体进行变性及复性后,并通过Zn²⁺螯合柱和SP阳离子交换柱进行纯化。质谱分析表明分子量为33.735kD,与理论值相符。目的蛋白质的纯度可达90%。纤维蛋白平板法测得嵌合分子的比活为90000IU/mg,与scuPA-32k的比活相近。体外血小板聚集实验表明融合蛋白有较强的抑制血小板聚集的功能,抑制常数IC50为0.31μmol/L。以上这些结果表明,该融合蛋白不但具有较强的溶栓功能,而且具有抗栓功能,可能是一种具有很好发展前景的双功能溶栓抗栓药物。