猪胰蛋白酶自溶后的活性产物

酶的催化作用起因于分子中某些部位氨基酸残基的特定空间结构,即“活性部位”的存在。使酶分子发生有限度的降解,观察它对酶活性的影响,乃至分离出具有酶活性的降解产物——“活性碎片”,这是研究酶的结构与功能的关系的方法之一。在这方面,胰蛋白酶特别引人注意,因为在一定条件下,无需外加蛋白酶,胰蛋白酶本身就能发生自溶作用;同时胰蛋白酶的高度的专一性对于确定肽链断裂的位置也是很有帮助的。     

白鲫鱼金属硫蛋白全长cDNA: MT-A, MT-B的克隆及其基因分型

应用阻抑性ＲＡＣＥ方法克隆得到白鲫鱼的两个ＭＴ全长ＣＤＮＡ（ＭＴ－Ａ和ＭＴ－Ｂ）,它们可读框间的同源性为９２．３％．用封闭式充氮层析系统得到高纯度的两个白鲫鱼肝ＭＴ蛋白,并用Ｅｄｍａｎ法测定了Ｎ－端氨基酸序列．据此证明了ＭＴ－Ｂ是表达ＭＴ－２蛋白的基因,ＭＴ－Ａ是表达ＭＴ－１蛋白的基因．此外测序过程中发现ＭＴ－１的Ｎ－端被封闭,而ＭＴ－２则是非封闭的,这提示它们在转录及翻译后调控机制的不同．白鲫鱼ＭＴ两基因的核酸序列和尾部非翻译区长度的差异（ＭＴ－Ａ约１５０ ｈｐ, ＭＴ－Ｂ约３６０ ｂｐ）,以及两 ＭＴ蛋白亚型的Ｎ－端封闭情况的不同,都为解释它们在组织中分布及其功能的差异性提供了线索．     

人小肠三叶因子的克隆及酶联免疫吸附检测

人小肠三叶因子的ｃＤＮＡ,克隆到原核表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中,经ＩＰＴＧ诱导后,ｈＩＴＦ以ＧＳＴ－ｈＩＴＦ融合蛋白的形式表达,融合蛋白占细菌总蛋白的１５％左右。经过Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和柱和Ｓｅｐｈａｃｒｙ１ Ｓ１００分子筛层析纯化了ｈＩＴＦ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和氨基酸分析证明得到了ｈＩＴＦ纯品。以天然ｈＩＴＦ为抗原免疫青紫蓝兔制备了抗血清,用纯化的ＩｇＧ建立了ｈＩ     

小鼠金属硫蛋白基因－I在CHO细胞中稳定表达及其在医疗方面的应用

将小鼠的ＭＴ－Ⅰ基因插入ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ质粒的ＥｃｏＲＩ位点，构建了具有ＳＶ４０和ＭＴ双启动子并正向插入ＭＴ－Ⅰ基因的表达载体。用改良的磷酸钙／ＤＮＡ沉淀法将表达载体导入ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞内，用不含次黄嘌呤（Ｈ）和胸腺嘧啶（Ｔ）的选择培养基筛选出稳定表达ＭＴ阳性克隆Ｄ－２２，经检测１０６细胞的ＭＴ表达量约为１．８μｇ，Ｄ－２２细胞对Ｃｄ２＋浓度抗性较之ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞高１４倍。为了研究金属硫蛋白对正常细胞所具有的保护作用，将不同浓度的顺铂分别处理无ＭＴ表达的ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞和有ＭＴ表达的Ｄ－２２细胞。实验发现顺铂对Ｄ－２２细胞和ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞５０％生长抑制浓度（ＩＣ５０）分别是０．１４５μｍｏｌ／Ｌ和０．０４μｍｏｌ／Ｌ。上述研究表明ＭＴ对正常细胞有一定的保护作用，因而通过诱导正常细胞提高ＭＴ的表达量，同时使用ＭＴ阻断剂阻断肿瘤组织的ＭＴ合成，这样可能会为治疗某些顽固肿瘤开辟一条新途径     

抗栓肽和尿激酶原(B链)嵌合体的构建与表达

通过基因工程重组技术,将抗栓肽(decorsin)基因与尿激酶的B链即scu-PA(B)基因用柔性Linker((Gly 4Ser)3)融合在一起,构建新的嵌合体基因dscuPA(B),在大肠杆菌R osetta(DE3)plysS中通过IPTG诱导表达, 并考察了重组质粒在Rosetta(DE3)plysS在传代中的分离稳定性.该融合蛋白在大肠杆菌中是以包涵体的形式存在,对包涵体进行变性及复性后,并通过Zn 2 螯合柱和SP阳离子交换柱进行纯化.质谱分析表明分子量为33.735 kD,与理论值相符.目的蛋白质的纯度可达90%.纤维蛋白平板法测得嵌合分子的比活为90000IU/mg ,与scuPA-32k的比活相近.体外血小板聚集实验表明融合蛋白有较强的抑制血小板聚集的功能,抑制常数IC50为0.31μmol/L.以上这些结果表明,该融合蛋白不但具有较强的溶栓功能,而且具有抗栓功能,可能是一种具有很好发展前景的双功能溶栓抗栓药物.     

山蛭素(haemadin)在毕赤甲醇酵母中的表达及其性质鉴定

人工合成山蛭素基因后,利用基因重组的方法将山蛭素的基因克隆到pPicZαA载体,经过线性化,电转至毕赤酵母GS115中表达.使用浓度高达1 500 μg/mL的zeocin筛选得到高拷贝插入的GS115-H菌株,经过优化摇瓶表达条件表达量达到100 mg/L.摇瓶培养物经离心取上清,分别使用3 kD和10 kD的超滤膜超滤,阳离子交换层析和凝胶过滤层析等纯化步骤之后,得到纯度高于95%的目的蛋白,产出量为40 mg/L,回收率为40%.通过以chromozym TH为底物的凝血酶酰胺水解实验证实了其体外生物学活性:其抑制凝血酶常数为(2.46±0.13)×10-13 mol/L.     

人胎盘G-蛋白Rab3a cDNA的克隆

为了获取全长的小分子G 蛋白Rab3a ,以用于研究Rab3a与其他蛋白相互作用关系 ,本实验以人胎盘总cDNA为模板 ,PCR扩增到人Rab3acDNA全编码区。产物回收后克隆于质粒pYESTrp2的BamHI XhoI位点 ,测序结果表明 ,本实验获得的Rab3acDNA包含了起始和终止密码子。与PCR引物设计的参照Rab3a比较有 5个核苷酸变异 ,与翻译的氨基酸序列完全一致。由此表明本实验获得的Rab3acDNA可用于进一步研究     

转小鼠金属硫蛋白基因集胞藻6803及其野生藻培养

通过摇瓶培养考察转小鼠金属硫蛋白基因集胞藻６８０３及其野生藻的光合自养培养过程中碳源浓度、氮源浓度和光照度对这两种藻生长的影响。野生藻的最适生长碳源浓度（０．０５－０．５ｇ／Ｌ）比转基因藻的最适生长碳源浓度（０．０２－０．０５ｇ／Ｌ）高。氮源浓度对转基因藻和野生藻的影响趋势相同。在０．３－４．５ｇ／Ｌ范围内,随着氮源浓度的增高,藻体生长的最大细胞浓度降低。转基因藻生长的最佳光照度为１５００ｌｘ,野     

金属硫蛋白清除羟自由基功能的研究

引言金属硫蛋白（Ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ,简称ＭＴ）是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。１９５７年Ｍａｒｇｏｓｈｅｓｅｔａｌ首次从马肾中分离出该蛋白,现发现ＭＴ几乎存在于所有生物体中。哺乳类动物的ＭＴ通常是一条６１个氨基酸的肽链,其中含有...     

镉诱导扁藻（Platymonas cardiformis）类金属硫蛋白的初步研究

以CdCl2作为诱导剂，用不同浓度的CdCl2对扁藻进行诱导培养，随着CdCl2浓度的升高，扁藻的生长率逐渐降低。扁藻不能耐受1mmol／L以上的CdCl2．对MTL提取液进行紫外吸收、原子吸收等测定，结果表明扁藻类金属硫蛋白的合成随着CdCl2浓度的升高而增大，至0．25mmol／L达到最大值，每克湿藻能获得1．98mgMTI，诱导效果显著。