Pax3a基因Homeobox domain结构域敲除斑马鱼的跨代遗传观察

目的:检测Pax3a的Homeobox domain结构域敲除后斑马鱼基因型和表型的稳定性.方法:利用CRISPR/Cas9技术双靶点整体敲除斑马鱼中Pax3a的Homeobox domain结构域,并建立F0代和F1代敲除斑马鱼.同时比较靶基因敲除的基因型和表型跨代遗传的影响.结果:两年的跟踪观察显示F1代Homeobox domain结构域敲除序列有延长和重组修复改变;瓦登伯革氏症候群病态表型比原先报道的Homeobox domain结构域过表达更明显,主要体现为色素颗粒松散和肠道细胞失去紧密连接.结论:斑马鱼Pax3a的Homeobox domain结构域的过表达或缺失都能妨碍Pax3的结构和功能完整性,导致不正常的细胞迁移和细胞间紧密连接.     

文昌鱼Pax1/9基因上游调控区的克隆及分析

脊椎动物Pax1/9是一重要的发育调控基因亚家族,文昌鱼基因组中仅有单一的该亚家族直系同源基因Amphi-Pax1/9,为检验此基因上游调控元件的功能在脊椎动物体内是否具有通用性,将文昌鱼Pax1/9基因上游约4.6 kb的侧翼序列与绿色荧光蛋白(GFP)报告基因连接,构建重组质粒表达载体(pAmphiPax1/9-AcGFP),显微注射斑马鱼胚胎,并以斑马鱼Pax1和Pax9的上游同源序列为阳性对照.结果表明,阳性对照斑马鱼胚胎中GFP能够表达,但注射pAm-phiPax1/9-AcGFP质粒的斑马鱼胚胎中无明显的GFP表达,这一现象可能是由于Pax1/9上游调控序列在二物种间存在较大的进化差异,启动元件具有物种特异性.     

乙肝病毒hbx基因诱导斑马鱼胚胎发育背部化畸形

为了研究HBX对胚胎发育的影响,从含有HBX基因的质粒上转录HBX mRNA,显微注射入斑马鱼早期胚胎,在bud期进行表型观察,并用全胚胎原位杂交法检测HBX对斑马鱼胚胎早期发育的影响,用脊索标记基因ntl和骨骼肌标记基因MyoD作为探针检测胚胎发育背部化的特征表型。首次发现HBX的表达引起斑马鱼胚胎早期发育背部化畸形,HBX过量表达的胚胎背部化表型与早期胚胎wnt缺失表达导致的胚胎发育背部化表型一致,HBX可能通过激活wnt/β-catenin信号通路的表达和调控,造成胚胎发育背部化的畸形。     

核酸酶I-SceI介导的转基因斑马鱼构建及连接蛋白Connexin48.5的定位研究

细胞连接蛋白是由多基因家族编码的一类结构相似、分子质量不同的蛋白质.在细胞膜上,每6个相同或不同的连接蛋白围绕中央孔排列形成一个连接子,相邻细胞膜上的连接子相互对接形成细胞间隙连接,细胞间隙连接是一种重要的通讯连接,它不仅是细胞间代谢偶联、冲动传导的结构基础,而且可以通过介导与细胞的迁移、分化、增生和器官形成有关的信号物质而在胚胎发育中起重要作用.为了进一步探讨细胞间隙连接在生物体中的作用,采用斑马鱼胚胎显微注射核酸酶I-SceI和质粒DNA的方法成功构建了绿色荧光蛋白GFP与细胞连接蛋白Connexin48.5融合表达的转基因荧光斑马鱼品系,并通过对荧光蛋白发光的观察在斑马鱼鱼体中进行连接蛋白Connexin48.5的定位.实验结果表明:核酸酶I-SceI介导下的斑马鱼转基因方法效率较高,可行性好;连接蛋白Connexin48.5在斑马鱼体内主要定位于眼球晶状体和脊索.所获得的Connexin48.5-GFP融合表达斑马鱼系,以及利用该品系进行的Connexin48.5定位研究对细胞连接蛋白在生物体内的功能研究将具有重要作用.     

微注射人TCP10L基因对斑马鱼形态的影响

利用模式生物斑马鱼,通过微注射的方法,研究了人肝脏特异性转录因子TCP10L对斑马鱼早期胚胎发育的影响.结果显示:人TCP10L基因对斑马鱼胚胎发育有一定的毒性.表现为早期的脊索发育异常,个体严重畸形;当血液循环出现后,表现为血流延缓和围心腔水肿等症状.该项研究表明:人肝脏特异性转录因子TCP10L在斑马鱼胚胎中的过表达会引起显著的形态异常和心血管障碍,并且这种影响与其是否在斑马鱼肝内的特异表达有关,为进一步探明该转录因子在人肝脏内发挥的功能奠定了基础.     

斑马鱼crip2基因的克隆、亚细胞定位及在胚胎发育早期的表达分析

斑马鱼广泛用于脊椎动物遗传和发育生物学的研究．为揭示包含具有LIM结构域的crip基因的功能,本文以斑马鱼为实验对象,克隆了斑马鱼的crip2基因,分别构建了crip2-Teasy 和crip2-egfp载体,从含有crip2基因的crip2-Teasy质粒上转录crip2 RNA 探针,并用全胚胎原位杂交法检测crip2在斑马鱼胚胎中的表达,用crip2-egfp对crip2进行亚细胞定位研究,发现crip2基因在斑马鱼胚胎早期没有表达,五体节开始在脊索特异表达;后期,主要局限于在血管、心脏和体节间肌肉,表明crip2的表达并不局限于内皮系统．在细胞内,crip2基因在细胞核和胞浆中均有表达．这些工作为进一步研究crip2基因的功能奠定了基础．     

斑马鱼SAA基因克隆及表达分析

利用巢式PCR(nest PCR)的方法克隆斑马鱼血清淀粉样蛋白A基因,并进行生物信息学分析.实时荧光定量PCR结果显示:SAA在斑马鱼胚胎发育时期的表达量呈现明显的“增长—稳定—增长”趋势.成鱼组织分布中,SAA在11个斑马鱼组织中均能检测到,在心脏和肝脏中相对高表达.     

小鼠胚胎脑特异表达的新基因bsg3的克隆及初步研究

通过消减差异筛选的方法克隆到一个在小鼠胚胎脑特异表达的基因bsg3(brain specific gene 3).它编码的蛋白与人的KIAA0961具有80.3%的同源性.bsg3基因包含一个1644bp的完整阅读框,编码一个含548个氨基酸,具有1个KRAB结构域(kruppel-associated box)和13个C2H2型锌指结构域的蛋白.该基因定位在小鼠第7号染色体上,包含5个外显子,4个内含子.以bsg3基因全长编码区为探针的原位杂交结果显示,bsg3在小鼠胚胎脑及鸡胚脑特异表达.半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的结果表明,在成体小鼠的组织中,bsg3基因脑中表达也较强.这提示bsg3基因可能在小鼠脑发育中起着重要的作用.对bsg3基因时间和空间的表达模式的分析将有助于进一步揭示它在脑发育及功能维持中的作用.     

镉对转基因斑马鱼的急性毒性效应

采用转基因斑马鱼T_g(lyz:EGFP)-Lyz fish为模型,探讨了重金属镉对转基因斑马鱼的胚胎毒性和免疫毒性.结果表明,相比空白对照组,0.1μM和1μM CdCl_2对斑马鱼胚胎产生一定的毒性影响,并促进溶菌酶(lysozyme C,lyz)标记的斑马鱼体内的中性粒细胞的荧光表达.随着CdCl_2浓度的增加,24 h血流障碍、56 h死亡数和56 h孵化抑制等指标均呈现递增趋势;在CdCl_2诱导下的斑马鱼仔鱼体内的中性粒细胞增多并向发生炎症部位分布,主要趋向于肝脏部位聚集.因此,本研究对转基因斑马鱼在环境污染物的免疫毒性检测方面有着重要意义.     

伽马辐照对斑马鱼胚胎谷胱甘肽还原酶活性及基因表达的影响

谷胱甘肽还原酶(GR)是一种重要的抗氧化酶,其在生物体的抗氧化系统中起着关键作用.为了研究伽马辐照对斑马鱼胚胎GR活性及基因表达的影响,本实验用不同的辐照剂量(0.01、0.05、0.1、0.5和1 Gy)分别对三个发育时期(原肠胚期、体节期和咽囊期)的斑马鱼胚胎进行了辐照处理.分析了各组GR的活性,并采用荧光实时定量PCR技术(qRT-PCR)检测了GR基因的表达水平.结果显示,伽马辐照以剂量依赖的方式调整了斑马鱼胚胎GR的活性及GR基因的表达.随着辐照剂量的增加,GR活性及其mRNA的相对表达量呈现先升高后回落的趋势.这表明,GR是一种可以对伽马辐照作出早期预警的生物标志物.斑马鱼胚胎可以通过上调GR基因的表达,来增加GR的合成,从而提高对伽马射线的防御能力.但是,这种反应和调整是有限度的.咽囊期胚胎比其它两个时期的胚胎对伽马射线的防御能力更强.     

LIM结构域蛋白KyoT基因剔除小鼠的建立和表型分析

KyoT为一LIM结构域蛋白,可与转录因子RBP-Jk相互作用而调节其转录活性.构建了KyoT基因剔除载体,转染小鼠胚胎干细胞(ES细胞)后得到同源重组的ES细胞克隆.将此ES细胞注射入小鼠的囊胚泡得到嵌合小鼠,再经小鼠培育得到KyoT基因被剔除的小鼠.纯合子KyoT基因剔除小鼠不能表达有功能的KyoT蛋白.表型分析表明纯合子KyoT基因剔除小鼠腹腔B1B细胞数增加,提示KyoT可能参与B淋巴细胞的发育.     

NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体的构建与表达

目的:运用pADxsi系统构建带人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体.方法:采用基因克隆技术,将目的基因NGN3从pEGFP-N1-NGN3质粒上切下连到pShuttle-GFP-CMV上,替换GFP,得到pShuttle-CMV-NGN3;再将PAX4从pEGFP-N1-PAX4质粒上切下连到系统pShuttle-CMV-NGN3上,得到pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4穿梭质粒;最后将CMV-NGN3/CMV-PAX4从pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4转移到ADxsi骨架载体上,得到pADxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4病毒质粒,然后在293细胞中进行包装与扩增活性病毒,并进行病毒滴度测定.体外感染人脐带间充质干细胞.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)与免疫印迹(Western blotting)检测目的基因在细胞内的表达情况, 免疫细胞化学与间接荧光法检测目的分子在细胞内的定位.结果:酶切鉴定和PCR证明重组人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体构建正确;RT-PCR与Western blotting结果显示目的基因在细胞持续稳定表达;间接荧光与免疫化学表明重组腺病毒可高效感染人脐带间充质干细胞,且目的基因特异性地定位于细胞核内.结论:应用重组技术成功构建人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体,且在间充质干细胞内持续而稳定表达.     

过表达转录因子AhAREB1对拟南芥生长素分布的影响

本课题组前期研究表明,过表达AhAREB1(花生AREB转录因子基因)植株矮小,叶片卷曲,抗旱能力增强,体内IAA含量升高,推测AhAREB1可能影响植株体内IAA分布.该文采用携带3个重复IAA化学诱导启动子元件的pDR5::GUS植株与AhAREB1过表达拟南芥植株的杂交纯合后代,通过GUS组织化学染色方法,探讨AhAREB1转录因子对植株体内IAA分布的影响.结果表明,过表达AhAREB1植株体内IAA增加,主要分布在幼苗的根尖和成苗的叶片边缘;在过表达植株IAA响应基因IAA29和IAA运输蛋白基因LAX3表达均显著下调,而IAA响应蛋白基因ARF2和ARF9显著上调.过表达AhAREB1植株体内IAA分布不均衡是引起表型变化的原因之一.     

利用RNAi观察线虫早期胚胎中与PAR蛋白相关的细胞极性

细胞极性对细胞命运决定有重要的作用.在本实验中,通过细菌介导RNAi观察par基因在线虫(Caenorhabditis elegans)早期胚胎发育中的作用.虽然不同的C.elegans par基因经过RNA干扰后早期胚胎表型不尽相同,但各个par基因都在维持细胞极性方面发挥作用,特别是对有丝分裂纺锤体位置和分裂时间的调节.     

基于CRISPR/Cas9系统制备猪Pax2基因敲除细胞系

肾脏发育缺陷或缺失的猪模型可为人源化肾脏器官在异种动物体内再生提供“发育空位”,因此敲除肾脏发育关键基因Pax2(Paired box2)获得该动物模型是肾脏再生的关键步骤。本文利用生物信息学分析软件比对分析了不同物种间Pax2蛋白结构，明确了猪Pax2蛋白在氨基酸序列、二级结构和三级结构方面与人、小鼠具有相似性。结合Pax2蛋白在人和小鼠肾脏发育中的功能，选择猪Pax2基因第8外显子序列作为打靶目标区间，设计并构建了用于敲除猪Pax2基因的CRISPR/Cas9打靶载体。在检测CRISPR/Cas9载体打靶猪Pax2基因效率的基础上，利用细胞核转染和G418药物筛选获得巴马小型猪细胞单克隆。通过PCR、T载体克隆和Sanger测序检测各细胞单克隆Pax2基因的敲除情况，鉴定出33个双等位基因敲除Pax2基因的巴马小型猪细胞系，敲除效率达到45.21%(33/73)。本研究为肾脏缺失或肾发育不全的猪模型的获得奠定实验基础，同时为后续在猪体内再造人源化肾脏以及肾发育疾病的研究提供了研究材料。     

3种重金属对斑马鱼的联合毒性及迷迭香酸的保护作用研究

对氯化镉、硝酸铅、硫酸铜3种重金属单一以及联合情况下对早期斑马鱼胚胎发育毒性的影响进行考察,并采用不同浓度的迷迭香酸进行干预,同时观察96 hpf胚胎的死亡率和孵化率.Cd-Pb、Cd-Cu、Pb-Cu、Cd-Pb-Cu对斑马鱼胚胎的毒性作用类型分别为协同作用、协同作用、拮抗作用、协同作用.60μmol/L RA对斑马鱼胚胎死亡、幼鱼畸形及胚胎孵化率无明显影响.Cd~(2+)-Pb~(2+)-Cu~(2+)联合处理,胚胎死亡率明显上升,60μmol/L RA与Cd~(2+)-Pb~(2+)-Cu~(2+)联合处理,胚胎死亡率降低约20%(P<0.01);胚胎凋亡细胞数目明显减少,Bcl-2/Bax的基因表达水平明显上调(P<0.01),Caspase 3基因表达下调(P<0.05).表明RA对Cd~(2+)-Pb~(2+)-Cu~(2+)的联合毒性具有保护作用,其机制可能与上调Bcl-2/Bax,降低Caspase 3基因表达,减少胚胎细胞凋亡有关.     

甲拌磷对斑马鱼胚胎的毒性研究

采用0(对照),10,20,40,80,160mg/L的甲拌磷给受精后4h的斑马鱼胚胎进行染毒,观察斑马鱼胚胎发育全过程,并在96h摄像,结果表明:斑马鱼卵在24h,48h的半致死浓度分别为25.63mg/L,14.96mg/L.染毒斑马鱼胚胎发育过程中出现尾部弯曲、心律消失、发育停止等特点.     

绿脓杆菌外毒素A与Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白嵌合表达质粒的构建及其免疫原性的研究

构建外毒素结构域Ⅰ a基因(EPA103)与Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-2-gD)嵌合蛋白表达载体(pET-EgD),得到嵌合表达蛋白.利用外毒素结构域Ⅰ a基因表达蛋白的佐剂效应,以pET-EgD表达嵌合蛋白免疫Balb/c小鼠.结果显示:嵌合表达蛋白(pET-EgD)免疫小鼠,可在小鼠体内诱导产生抗HSV-2特异性抗体.嵌合表达蛋白(pET-EgD)具有较强的免疫原性,为开发研究Ⅱ型单纯疱疹核酸疫苗奠定了基础.     

白藜芦醇对CdCl_2暴露所致斑马鱼胚胎发育毒性干预作用及机制的初步研究

为考察天然抗氧化剂白藜芦醇(Res)对Cd Cl2暴露所致斑马鱼胚胎发育毒性的干预作用,并初步探讨其作用机制。采用单独应用Res联合Cd Cl2共同处理受精后2 h(2 hpf)的斑马鱼胚胎,观察至96 hpf胚胎死亡率和孵化率;采用荧光探针DCFH-DA、Mito SOX、JC-1分别检测胚胎总体活性氧、线粒体源ROS水平和胚胎线粒体的膜电势;采用吖啶橙(AO)染色法检测细胞凋亡情况;采用Real-time PCR方法检测胚胎线粒体单链DNA结合蛋白(mt SSBP)、OPA1的表达水平。结果显示,100μmol/L Res持续暴露96 h可明显增加斑马鱼胚胎死亡率(P0.05)。20~100μmol/L Res与20 mg/L Cd Cl2联合暴露较单独Cd Cl2暴露组相比,胚胎死亡率和未孵化率明显增加(P0.01)。100μmol/L Res与20 mg/L Cd Cl2联合处理明显增加了胚胎总体ROS(P0.01)和线粒体内ROS(P0.01)的生成,降低了线粒体的膜电势(P0.05),胚胎细胞凋亡细胞数量明显增加。与Cd Cl2单独暴露组相比,Res联合处理明显下调了mt SSBP和OPA1的m RNA表达水平(P0.01)。由此可知,高浓度Res明显增强Cd Cl2所致的斑马鱼发育毒性,胚胎总体ROS和线粒体源ROS水平升高,线粒体膜电势下降,mt SSBP和OPA1表达下降,表明线粒体损害可能介导了Res对Cd Cl2育毒性的增敏作用。     

斑马鱼Cyclin C的cDNA克隆及其在发育过程中的表达

细胞周期蛋白C(cyclin C)与细胞周期依赖性蛋白激酶cdk8结合,通过磷酸化RNA 聚合酶 II 和 TFIIH调控转录.在脊椎动物胚胎发育过程中有关细胞周期蛋白C合子型转录激活机制尚知甚少.本研究克隆了斑马鱼细胞周期蛋白C基因,并用Northern杂交和整体原位杂交技术检测其在胚胎发育过程中的表达状态.结果显示,斑马鱼细胞周期蛋白C高度保守,与人细胞周期蛋白C有88％的蛋白序列同源;斑马鱼细胞周期蛋白C在母型期开始表达,其表达伴随中囊胚转换时期的合子型转录激活以及整个胚胎发育过程.