家蚕碱性磷酸酶的功能基团研究

用PCMB、NBS、PMSF、TNBS、SUAN、DTT、BrAc、IAc等在一定条件下选择性修饰家蚕碱性磷酸酶的部分氨基酸残基,对酶活力的变化进行测定.结果表明:PMSF、SUAN、BrAc、IAc和TNBS的修饰能显著抑制酶的活性,且酶活力降低程度与修饰剂的浓度相关;PMSF、DTT和NBT的修饰对酶的影响较小.初步认为,巯基和组氨酸的咪唑基可能是家蚕碱性磷酸酶的必需功能基团,赖氨酸残基和二硫键对保护酶的催化能力是必需的.     

黄鳝蛋白酶的化学修饰

采用NBS，BrAc，IAC，TNBS，PCMB，PMSF，2-ME7种化学修饰剂及Ca^2 ．Mg^2 ，Na^2 ，K^2 ，Cu^2 等9种金属离子和EDTA试剂对黄鳝蛋白酶进行处理，检测酶活性变化，以研究酶分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系。及金属离子和EDTA对酶活性的影响．实验结果表明；NBS．BrAe，IAC，TNBS，PMSF对酶的抑制作用很强，而PCMB，2-ME对酶活性影响不大。说明色氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基和丝氨酸残基的化学修饰对酶的活性影响很大。为酶活性的必需基团。而巯基、二硫键等与酶活性无直接关系．Cu^2 ，Ba^2 对酶的活性具有激活作用，Mg^2 ，Li 和K 对酶有轻微的抑制作用，而Pb^2 ，Mn^2 和EDTA对酶有很强的抑制作用，Ca^2 ，Na^2 对黄缮蛋白酶既无明显的激活作用，也无明显的抑制作用．     

僧帽牡蛎碱性磷酸酶功能基团的研究

采用化学修饰法研究僧帽牡蛎碱性磷酸酶活性功能基团性质.酶经0.4mmol·L-1PCMB修饰30min后活力仍然保持不变,提示巯基与酶的活力无关;用二巯基苏糖醇(DTT)对酶进行修饰,当DTT浓度达到2.5mmol·L-1时,酶活力丧失98%,表明硫 硫键与酶活力有密切的关系;以N 溴代琥珀酰亚胺(NBS)修饰酶的色氨酸残基,酶的修饰失活呈一级反应,当NBS浓度达到0.65mmol·L-1时,酶活力丧失100%,并辅以紫外吸收光谱的变化分析,表明色氨酸残基是酶催化活力所必需的;醋酸酐、马来酸酐、甲醛等氨基试剂对酶的修饰作用显示氨基是酶的必需基团.     

菜青虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性必需基团的研究

从菜青虫表皮分离纯化N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase），获得电泳单一纯的酶制剂，通过化学修饰法研究该酶的活性必需基团．分别以碳化二亚胺（EDC）、N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、对-氯汞苯甲酸（pCMB）、二硫苏糖醇（DTT）、澳代乙酸（BrAc）和乙酰丙酮在特定条件下对该酶进行特异的化学修饰，结果表明酸性氨基酸的侧链羧基、半胱氨酸巯基、色氨酸的吲哚基、组氨酸的咪唑基、二硫键被修饰后，酶活性均显著下降，因此这些氨基酸残基是酶活性的必需基团，而精氨酸残基及赖氨酸ε-氨基被修饰后对酶活力没有影响，不是酶的必需基团．     

缢蛏碱性磷酸酯酶功能基团的化学修饰

用PMSF、TNBS、NBS、DTNB及溴代乙酸在一定条件下分别选择性地作用于缢蛏两种碱性磷酸酯酸(AKPⅠ和AKPⅡ)的Ser、Lys、Trp、His及巯基,并对酶活力的变化和吸收光谱的变化作了相应的测定。结果表明,PMSF、TNBS和NBS的修饰能显著抑制AKPⅠ和AKPⅡ的活力,活力的降低与修饰剂的浓度有关;溴代乙酸和DTNB对AKPⅠ和AKPⅡ的活力不表现抑制作用。我们初步认为,Ser、Lys和Trp残基可能是AKPⅠ和AKPⅡ的活力必需基团。AKPⅠ的TNBS失活动力学研究还表明一个Lys践基是AKPⅠ表现催化活力所必需的。     

Aspergillus ficuum菊粉酶的化学修饰和荧光光谱

选用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、焦碳酸二乙酯(DEPC)、丁二酮(DIC)、氯氨-T(Ch-T)、碳二亚胺(EDC)、苯甲基磺酰氟(PMSF)和二硫苏糖醇(DTT)等化学修饰剂,通过对Aspergillus ficuum内切和外切菊粉酶进行修饰,以研究菊粉酶分子中氨基酸侧链基团对酶活性的影响.研究结果表明:内切菊粉酶和外切菊粉酶活性中心的必需氨基酸残基均含有色氨酸和羧基氨基酸,且内切和外切菊粉酶活性中心的色氨酸残基数目分别为1和2;组氨酸可能是酶活性中心的组成基团.荧光光谱法研究表明:内切菊粉酶的色氨酸残基比外切菊粉酶的色氨酸残基所处环境的极性大,对环境的变化更敏感,并且更加暴露,表明这两种酶具有不同的构象,这种构象上的差别可能是导致二者对底物菊粉作用机理不同的原因.     

中华猕猴桃蛋白酶催化功能基团的研究

从野生中华猕猴桃分离提纯得SDS电泳单一纯酶制剂,酶蛋白的总巯基数为7,其中游离巯基数为1.3×10~(-5)MpCMB使酶活力丧失100％,酶修饰失活呈一级反应,表明酶分子的唯一游离巯基为该酶催化活性的必需功能基团.酶在2×10~(-4)M PMSF,活力仍不受影响,提示Ser残基与酶的催化功能无关.以Na_2S_4O_6保护游离巯基,用NBS修饰Trp残基,并辅以紫外光谱和萤光光谱分析.结果表明Trp残基为酶催化功能所必需.初步的CDC化学修饰结果亦表明,羧基似与酶催化活性有关.     

修饰剂对青霉菌葡萄糖氧化酶的效应研究

研究了几种修饰剂对青霉菌(Penicillium amagasakiense)葡萄糖氧化酶(GOD,EC 1.1.3.4)活力的影响.结果表明,溴代乙酸、N-溴代丁二酰亚胺(NBS)、乙酰丙酮等对酶的抑制作用较强,随着抑制剂浓度增大,酶活力呈指数下降,酶活力下降50%的抑制浓度分别为40.8,28.5和8.7 mmol/L,认为咪唑基、吲哚基、精氨酸胍基是该酶的活性功能基团,而蛋白质分子中巯基、二硫键、赖氨酸的ε-氨基、丝氨酸残基与酶活力无关.进一步研究了NBS的抑制动力学,结果显示:NBS对酶的抑制作用为非竞争性可逆抑制,抑制常数(KI)为19.2 μmol/L.该研究对青霉菌GOD在生产上的应用具有一定的理论指导意义.     

文昌鱼酸性磷酸酯酶的化学修饰

用DEAE-纤维素(DE-22)并改进酶的提纯方法,聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一蛋白区带的酶制剂比活力为359μM/mg(E)/min(Npp为底物)·用凝胶过滤法测得该酶分子量为58600,氨基酸组成有20种,共467个氨基酸残基。10~(-4)M pCMB使酶活力丧失98％;1×10~(-3)M PMSP该酶活力丧失96％,2×10~(-4)M NBS以及1×10~(-2)M BrAc酶活力均丧失90％·酶修饰失活呈一级反应,修饰过的酶紫外280nm吸收峰消失·初步判断文昌鱼AcPase分子上的Cys,Trp,His,Ser等氨基酸残基可能是酶的活力必需基团。     

文昌鱼酸性磷酸酯酶色氨酸残基的修饰

从厦门文昌鱼(Branchiostonia belcheri Gary)分离纯化获得聚丙烯酰胺胶电泳单一蛋白区带的酸性磷酸酯酶(EC3.1,3.2)应用化学修饰方法,荧光以及紫外-可见光谱的变化,探讨Trp残基与酶活力的关系,被NBS修饰的Trp基团仅有一个Trp残基被氧化时,酶活力丧失90％,该Trp残基为ACPase表现活力所必需,而且优先被氧化、从光谱扫描(230～600nm)结果表明,经NBS修饰以后的酶构象发生变化,文昌鱼ACPase的Trp残基和酶分子上的铁离子等基团均为酶活力的必需基团,推测两者可能以配位结合,共同维持酶活力中心的构象。     

综合利用清平磷矿废料的一种简单可行的办法

介绍了综合利用高Ａｌ低Ｐ含量的清平磷矿废料的一种简单可行的办法．在焙烧清平磷矿废料的硫酸浸取液中加入硫酸铵，在酸性条件下，在常压及５℃的低温下，使铝铵钒（ＮＨ４Ａｌ（ＳＯ４）２·１２Ｈ２Ｏ）大量结晶，从而导致Ｐ和Ａｌ分离．到目前为止，Ａｌ２Ｏ３的总浸取率在８０％以上，其回收率在９０％以上．最后，从残余Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋和部分ＳＯ２－４被除去的滤液中，通过石灰水分步中和、沉淀，能得到合格的饲料磷酸氢钙和磷肥．     

限制性核酸内切酶Pst Ⅰ活性基团的研究

分别以N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）,2,3-丁二酮和N-乙基-5-苯基异口唑-3’-磺酸盐作修饰剂,研究色氨酸,精氨酸残基和羧基对RtⅠ活性的影响．结果表明,NBS的修饰虽可导致Pst Ⅰ活性丧失,但紫外吸收光谱和SDS-PAGE研究结果表明色氨酸残基并非Pst Ⅰ的活性基团,而精氨酸残基和羧基的修饰可导致PstⅠ和Rst Ⅰ活性丧失,并按Keech和Farrant动力学方法分析得出无论在原活性还是星号活性条件下,有一个精氨酸残基和两个羧基是Pst Ⅰ的活性基团．     

中华猕猴桃蛋白酶赖氨酸残基的作用

有关中华猕猴桃蛋白酶(Actinidin,EC 3,4,22,14)催化功能基团的研究表明一个游离巯基,一个组氨酸残基为酶催化活性中心必需基团;色氨酸残基为酶活力表现所必需;羧基似与催化活性有关。迄今尚未见到有关赖氨酸残基作用的报道。本文应用TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)修饰动力学方法和光谱分析,进一步探讨了赖氨酸残基与Actinidin催化活性之间的关系。有关酶的分离提纯鉴定及酶活力测定均参照文[4],其它实验条件见图注。     

富士苹果中多酚氧化酶活性的中心必需基团与抑制动力学

以源于苹果的多酚氧化酶(PPO)为对象,选取溴乙酸、乙酰丙酮、N-溴代琥珀酰亚胺、1,4-二硫代苏糖醇和对氯汞苯甲酸等具有相对专一性的氨基酸基团修饰剂,研究PPO的酶活性中心必需基团,并确定乙醇对PPO的抑制动力学特性.结果表明:富士苹果中的PPO蛋白结构中酶活性中心必需基团有组氨酸的咪唑基、精氨酸的胍基与色氨酸残基.抑制动力学实验表明:乙醇通过与PPO酶活中心基团的结合抑制PPO酶活性,其对PPO的半抑制浓度(IC50)为0.14mmol.L-1,抑制类型为可逆的竞争性抑制.     

文昌鱼碱性磷酸酶赖氨酸基团的研究

关于文昌鱼碱性磷酸酶(AKP)的基本性质及功能基团等,本实验室作了系统的研究,判定1个色氨酸残基为酶活性中心所必需,赖氨酸残基(Lys)是AKP活性必需基团之一,而每分子AKP上含有36个Lys。在此基础上,采用化学修饰剂对Lys基团进行定量研究,并探讨其它功能基团的性质,为酶的结构与功能关系提供进一步的信息。     

藻红蓝蛋白裂合酶F亚基中色氨酸残基的化学修饰

以N-溴代琥珀酰亚胺作为修饰剂,对藻红蓝蛋白裂合异构酶F亚基中的色氨酸(Trp)残基与酶活性的关系进行了研究.研究表明, PecF的Trp残基均位于分子内部,NBS的修饰导致了酶活性的显著降低,但并未完全失去活性.酶被修饰后的荧光和圆二色谱均发生了变化,为酶的结构和功能间关系研究提供了重要信息.     

化学修饰对川泽泻凝集素生物学活性和构象的影响

用特异性化学修饰和荧光光谱的方法分析川泽泻凝集素(APL)活性位点氨基酸的分布情况.研究结果发现,色氨酸的化学修饰使活性降低80%,统计出每分子APL含有2个色氨酸残基,一个色氨酸位于凝集活性中心,另一个位于分子表面的疏水袋中,与凝集活性无关.精氨酸的化学修饰使活性降低50%,半胱氨酸的化学修饰使活性完全丧失.天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸等化学修饰后凝集活性无明显变化.表明色氨酸、精氨酸和半胱氨酸对凝集素的凝集活性中心的构成起重要作用,天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸等氨基酸位于凝集素的凝集活性中心附近,只是在维持凝集素分子的构象上具有一定的作用.