文昌鱼碱性磷酸酶的分子量及氨基酸组成的初步研究

经凝胶过滤法测得文昌鱼(Bronchiostoma belcheheri Gray)碱性磷酸酶的分子量为138,000,用等电聚焦电泳法测得其等电点为4.79,用氨基酸自动分析仪测得该酶的氨基酸组成共20种和1117个氨基酸残基。     

中华猕猴桃蛋白酶催化功能基团的研究

从野生中华猕猴桃分离提纯得SDS电泳单一纯酶制剂,酶蛋白的总巯基数为7,其中游离巯基数为1.3×10~(-5)MpCMB使酶活力丧失100％,酶修饰失活呈一级反应,表明酶分子的唯一游离巯基为该酶催化活性的必需功能基团.酶在2×10~(-4)M PMSF,活力仍不受影响,提示Ser残基与酶的催化功能无关.以Na_2S_4O_6保护游离巯基,用NBS修饰Trp残基,并辅以紫外光谱和萤光光谱分析.结果表明Trp残基为酶催化功能所必需.初步的CDC化学修饰结果亦表明,羧基似与酶催化活性有关.     

长毛对虾碱性磷酸酶功能基团的研究

用对－氯汞苯甲酸修饰该酶分子中的巯基，酶活力不受影响，说明该酶不是“巯基酶”．用Ｎ溴代琥珀酰亚胺修饰酶后，活力完全丧失，修饰后的酶在２７５ｎｍ处的紫外吸收峰完全消失，３４０ｎｍ处荧光发射峰也逐渐下降至完全淬灭，说明色氨酸残基是酶活性必需基因之一．用甲醛、醋酸酐修饰氨基，溴代乙酸修饰咪唑基也可以使酶活力完全丧失，说明赖氨酸残基及组氨酸残基也是酶活性功能基因．用乙酰丙酮修饰精氨酸残基，酶活力下降了５０％，精氨酸残基可能与维系酶分子构象有关．     

脲对果菠萝蛋白酶的变性与失活动力学

以脲为变性剂,以荧光光谱为监测手段,对果菠萝蛋白酶(Fruit bromelain)的分子构象变化进行研究,酶的荧光强度随脲浓度增大而递增,发射峰出现红移。荧光偏振在 230～240 nm及 260～290 nm 出现二个负峰,后者较为显著,并随脲浓度增大而加剧。脲对酶水解N-苄氧羰酰 L-赖氨酸对硝基酚酯(CBZ-Lys·pNP)活力的影响,表现为非竞争性抑制类型;比较脲对游离酶(E)及结合酶(ES)的失活速度常数。结果二者相等,底物不表现保护作用。测定酶在不同浓度脲中的变性速度常数和失活速度常数,比较了酶的构象变化及催化活力的关系,酶的失活速度常数比变性速度约大6～16倍。说明酶活性中心对脲的敏感性,酶活力的表现很大程度上依赖于酶构象的稳定性和完整性。     

中华猕猴桃蛋白酶热失活动力学

改进了酶的提纯方法获得聚焦电泳为单一区带酶制剂。酶热失活以 HbCO 为底物时为一级反应,动力学方法表明 HbCO 对酶的热失活有保护作用,68.90℃时k_(+0)/k′_(+3)比值24,“HbCO”络合物活化能 535kJ/mol,焓 531 kJ/mol,自由能 116kJ/mol,熵1 212kJ/mol,生成自由能和生成热分别为20和209kJ/mol,这些参数说明 HbCO对酶热失活保护作用以及对酶构象影响可能与二者的多键结合和HbCO 水化作用有关。本文中还得到CBZ-Lys-ONp 为底物的热力学参数,观察到 DTT 对酶热失活保护是很小的。     

文昌鱼碱性磷酸酶的必需基团研究

对文昌鱼碱性磷酸酶的化学修饰研究结果表明:二硫键、赖氨酸残基和色氨酸残基与酶活性有关系。动力学方法测定酶活性基团的解离常数PK值为10.3,这数值与赖氨酸的ε-氨基的解离有关。活性基团的定量分析表明每个酶分子只有一个色氨酸残基是酶活性所必需的。     

文昌鱼碱性磷酸酶的动力学初步研究

从厦门文昌鱼中部份提纯一种碱性磷酸酶,并对该酶作用的动力学进行了初步的研究。该酶作用于底物磷酸苯二钠的最适pH为10.1,最适温度为40℃,测得其米氏常数值(K_m)为1.1×10~(-3)M,pH影响K_m值而不影响最大反应速度(V),表现为竞争性类型。Mg~( )有明显的激活作用,而Zn~( ),EDTA,DFP,ME及PCMB等在一定浓度范围内,表现为非竞争抑制类型。ME的抑制作用表明硫硫键是维持酶活力所必需的。从pH对酶的活力影响,测得有关酶活性基团解离的pK值为9.82,在不同温度条件下,测得该酶的活化能为3.16仟卡/克分子,其温度系数为1.15(30—40℃)。     

文昌鱼碱性磷酸酶功能基团的修饰与酶活力变化关系

用DEAE-Cellulose(DE-11)改进了酶的分离提纯方法,将酶提纯163倍,初步获得电泳均一的酶制剂。酶经光氧化后,活力迅速丧失,其失活过程按一级反应进行。酶经N-溴代琥珀酰亚胺作用后活力逐渐丧失。溴代乙酸在较高浓度下亦能抑制酶活力。酶经酰化后活力亦受抑制。实验结果初步表明:咪唑基吲哚基及氨基都是酶活力所必需的基因。     

猕猴桃蛋白酶在胍中“慢构象快活力变化”现象

比较了猕猴桃蛋白酶(Actinidin)在盐酸胍中变性时的荧光变化与活力变化的关系。当胍浓度为0.1 mol/l时,酶的最大荧光发射波长λ_(max)不变,荧光强度上升。此时酶被激活,活力提高25％,激活速度比变性速度快5.0倍。胍浓度逐渐增大,酶λ_(max)略红移,4.0 mol/l时达336 nm。但荧光强度降低,酶表现为快相和慢相失活的二个一级反应,失活速度常数比变性速度常数快 1～3个数量级。Actinidin 的激活与失活现象显示这可能与活性部位相关的 Trp 微环境的构象变化有关。胍变性结果指出 Actinidin 构象变化速度小于活力变化速度,这代表酶变性反应时慢构象变化快活力变化的一种模式。     

变性剂作用下文昌鱼碱性磷酸酶构象与催化活力变化

研究了文昌鱼碱性磷酸酶(AKP)的变性作用,结果表明:低浓度盐酸胍(0.5 mol/l,1.0 mol/l)对该酶具有明显激活作用;酶的荧光构象变化指标随脲浓度增大呈现两个陡变区(1.0～2.0 mol/l,4.0～8.0 mol/l),蜂位因变性剂存在而明显红移,表明肽链己发生较明显的伸展,该酶的失活与变性过程均为一级反应,低浓度脲(2.0 mol/l)作用表现为构象变化略快于失活,而高浓度盐酸胍(2.0 mol/l,4.0 mol/l)及高浓度脲(4.0 mol/l,6.0 mol/l,8.0 mol/l)作用均表现为失活略快于构象变化。