中华猕猴桃蛋白酶催化功能基团的研究

从野生中华猕猴桃分离提纯得SDS电泳单一纯酶制剂,酶蛋白的总巯基数为7,其中游离巯基数为1.3×10~(-5)MpCMB使酶活力丧失100％,酶修饰失活呈一级反应,表明酶分子的唯一游离巯基为该酶催化活性的必需功能基团.酶在2×10~(-4)M PMSF,活力仍不受影响,提示Ser残基与酶的催化功能无关.以Na_2S_4O_6保护游离巯基,用NBS修饰Trp残基,并辅以紫外光谱和萤光光谱分析.结果表明Trp残基为酶催化功能所必需.初步的CDC化学修饰结果亦表明,羧基似与酶催化活性有关.     

中华猕猴桃蛋白酶羧基的化学修饰

有关中华猕猴桃蛋白酶(Actinidin,E C 3、4.22.14)催化功能基团的研究表明:CYSH—25、His—161为酶活性部位必需基团,而Lys和Trp残基为酶活力表现所必需。本文中报道应用水溶性碳二亚胺(EDC)修饰动力学方法,进一步探讨羧基     

十二烷基硫酸钠对猕猴桃蛋白酶的变性作用

应用光谱法观测酶的结构变化,紫外差光谱显示在233nm有一较明显的差吸收负峰,在286nm、300nm左右有不大的负峰和在265nm的正峰;荧光谱显示327nm的相对荧光强度随SDS浓度的增高而递减;发射峰位置红移,酶受SDS>4.1mmol/1作用1h,可引起310nm新荧光发射肩。动力学资料表明,SDS对酶的变性过程为一级反应;酶的失活分快慢相,呈现二个一级反应,同时测定在SDS作用下actinidin的变性与失活速度,表明酶的失活速度大于变性速度,似可认为低浓度SDS能使结构域相错开,从而敏感地改变活性部位的微区结构,导致酶快速失活,提高SDS浓度则使酶的结构域发生构象变化,引起光谱法所显示的特征。     

中华猕猴桃蛋白酶在半极性介质中的构象变化和动力学研究

三种有机溶剂,二氧六环、二甲基甲酰胺和乙二醇,都不同程度地抑制中华猕猴桃蛋白酶催化水解赖氨酸对硝基本酯(CBZ-LYS-pNP)能力,其动力学行为符合Michaelis-Menten方程式,二氧六环的抑制作用类似于竞争性抑制类型,二甲基甲酰胺和乙二醇为非竞争性抑制,其抑制常数,分别为k_1=5.6×10~(-2)、0.58和1.60mol/L,光谱分析表明,酶在有机溶剂中,空间构象也发生了变化,随着二氧六环和二甲基甲酰胺浓度的增大,酶分子的α-螺旋度下降,无规卷曲度上升,荧光发射强度比天然酶略有增高或降低,变化的规律性不够,紫外差光谱显示,酶在6％二甲基甲酰胺中有一个243nm的负峰,此负峰随浓度的增大而增大,并略向红移,在24％二甲基甲酰胺中,负峰红移至248nm处。     

中华猕猴桃蛋白酶分离提纯及性质研究

以中华猕猴桃鲜果为材料,经调节pH,硫酸铵盐析,除果胶以及DEAE—纤维素(E22)柱层折纯化,获得电泳单一区带酶制剂。以牛碳氧血红蛋白为底物,酶的最适温度为45—50℃,最适pH为3.7—4.0,K_m值为2.78×10~(-5)M,K_(cat)为2.01×10~2/min,pH影响V_(max)而不影响K_m值,表现为非竞争性抑制作用。该酶的活活化能为6.84kcal/mol,ΔH为6.24—6.20kcal/mol(30—50℃),同时还进行了酶的热稳定性研究。     

中华猕猴桃蛋白酶赖氨酸残基的作用

有关中华猕猴桃蛋白酶(Actinidin,EC 3,4,22,14)催化功能基团的研究表明一个游离巯基,一个组氨酸残基为酶催化活性中心必需基团;色氨酸残基为酶活力表现所必需;羧基似与催化活性有关。迄今尚未见到有关赖氨酸残基作用的报道。本文应用TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)修饰动力学方法和光谱分析,进一步探讨了赖氨酸残基与Actinidin催化活性之间的关系。有关酶的分离提纯鉴定及酶活力测定均参照文[4],其它实验条件见图注。