蝴蝶兰查尔酮合酶基因cDNA的克隆、鉴定及其原核表达

利用逆转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)得到在蝴蝶兰花瓣中特异性表达的查尔酮合酶cDNA(pchs-1)．DNA序列分析表明,该序列与已发表的查尔酮合酶基因有很高的同源性．将此cDNA序列不改变阅读框架克隆到pET-24α( )原核表达载体上,经IPTG诱导后,SDS-PAGE的结果表明有预测大小的蛋白受诱导表达,该基因在植物中的功能验证工作正在进行中．     

乙型肝炎病毒聚合酶基因在重组腺病毒系统中的表达

乙型肝炎病毒是一种重要的人类病原,乙肝病毒聚合酶在病毒的复制中具有关键作用．拼接了HBV56的聚合酶全长基因,利用重组腺病毒系统,在HEK293细胞中表达乙肝病毒聚合酶．通过一种半定量PCR方法,检测到所表达的蛋白具有逆转录酶活性．这一研究对深入认识该酶结构与功能的关系,研制抑制病毒复制的药物,有一定的意义．     

雏鹅新型病毒性肠炎病原快速检测技术的建立及应用

根据小鹅瘟病毒(GPV)和鹅源禽腺病毒(FAV)基因组序列特征分别设计了各自的PCR引物,经对反应条件的优化建立了能同时检测两种病毒的二重PCR方法．该法能从雏鹅新型病毒性肠炎和小鹅瘟疫苗株以及分离的鹅源腺病毒蚀斑克隆株分别扩增出相应的特异性产物,而对其它常见鹅病的病原及正常鹅胚肝组织的扩增结果均为阴性;对来自广西不同地方的36份临床病例样品的检测发现,其中具有雏鹅新型病毒性肠炎典型病变的22份样品均可检出GPV和FAV两种病毒．其它的有4份只检出GPV,3份只检出FAV;12份健康雏鹅肝组织中仅有一份检测到GPV;健康成鹅泄殖腔中GPV和FAV的检出率分别达44．29％、37．14％二者都有的占1．43％．结果表明,雏鹅新型病毒性肠炎的病原可能包括GPV和FAV两种病毒;建立的PCR诊断技术具有快速、敏感、特异的特点,可用于该病征的临床快速鉴别诊断以及流行病学的调查研究．     

RT-qPCR检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因 转录水平方法的建立

目的 建立实时荧光定量(RT-qPCR)检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH/XO)基因转录水平的方法,以在转录水平上对XDH/XO基因进行定量检测。方法 提取Wistar大鼠肝脏组织中总RNA,经逆转录得到cDNA, 以10倍为稀释因子稀释为5个浓度梯度,使用设计的引物序列和内参基因进行RT-qPCR检测,得到XDH/XO基因表达的标准曲线。进而检测Wistar大鼠高尿酸血症动物模型中XDH/XO基因转录水平的变化。结果 RT-qPCR法检测得到的XDH/XO基因标准曲线溶解峰单一,R2接近1,能检测出高尿酸动物模型中XDH/XO基因转录水平的变化。结论 RT-qPCR检测Wistar大鼠XDH/XO基因转录水平的方法具有定量准确,重复性好的特点,可应用于高尿酸血症的发病机理、新药研究等方面。     

六种核酸提取试剂盒对粪样中小鼠肝炎病毒核酸 提取效率的比较

目的 比较六种商品化试剂盒在小鼠粪便中提取小鼠肝炎病毒(MHV)RNA的效率,筛选出效率高、耗时短的核酸提取方法。方法 采集感染MHV小鼠的新鲜粪便样本,分别用液氮研磨法、磁珠匀浆法以及PBS溶解离心法进行处理,通过同一核酸提取试剂盒比较病毒核酸提取效率,明确最佳样本前处理方法;之后,用6种试剂盒进行RNA提取,经反转录后进行TaqMan实时定量PCR检测,以Ct值评价6种试剂盒的提取效率,结合产物测序和血清抗体ELISA结果,筛选MHV的最佳核酸提取方法。结果 对于粪便样本的前处理,液氮研磨法的RNA提取效率显著高于磁珠匀浆法。对于6种试剂盒的提取效果,TIANGEN DP422[总RNA浓度：(549.70±52.38) ng/μL,Ct值：(24.51±0.10)]核酸提取效率最高;TIANGEN SD101[总RNA浓度：(274.13±6.87) ng/μL,Ct值：(2.39±0.017)]和QIAGEN 52904[总RNA浓度：(288.13±15.11) ng/μL,Ct值：(2.40±0.012)]用时最短;XS VRL[总RNA浓度：(348.80±15.85) ng/μL,Ct值：(24.70±0.13)]操作最为方便。结论 粪便样本前处理建议采用液氮研磨法。针对粪便中MHV RNA的提取,TIANGEN DP422提取效率最高,推荐用于小鼠肝炎病毒的分子生物学检测。     

稻纵卷叶螟一个DELTA家族谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆、序列分析与表达模式

谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferases ,GSTs）在昆虫代谢各种内源和外源性有害化合物的过程中起关键作用。重要水稻害虫稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）的GST基因目前尚无研究。本实验克隆了一个稻纵卷叶螟delta家族GST基因的全长cDNA序列,命名为CmGSTd3（Genbank登录号KM433686）。CmGSTd3包含681 bp的开放阅读框,编码一个由226个氨基酸组成的蛋白。CmGSTd3蛋白是一个胞质GST ,与已知的昆虫delta家族GST 具有较高的同源性。在系统进化分析中,CmGSTd3与家蚕的delta家族GST聚在同一进化分支上。实时荧光定量PCR结果显示,CmGSTd3基因在稻纵卷叶螟幼虫阶段表达量最高,且主要表达于幼虫的中肠和脂肪体,由此推测其可能参与了体内异源毒物的代谢。本研究为探索CmGSTd3的生理功能奠定了前期基础。     

中国东北条子河中微生物群落变化与锌砷污染的关系研究

研究目的：通过研究河流微生物与污染物的互作关系,为河流污染治理等相关研究提供新途径。创新要点：研究选择的目标河流是报道较少的辽河二级支流,该研究对于了解支流污染特别是东北地区河流污染有重要的意义。将分子生态学技术应用于分析不同污染程度的河流底泥微生物变化,建立微生物种群变化和污染物的互作关系。研究方法：选取沿条子河的8个代表性区段,分析河水和底泥中重金属和污染物的变化情况。通过变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术分析不同河流区段内真核和原核微生物种群变化,解析河流中污染物对底泥微生物的影响,建立微生物种群变化和重金属污染的互作关系。重要结论：重金属污染物的存在能抑制底泥中微生物生长,仅少量具有较强抗性的微生物存活（见图4）;有机污染物的增加使对重金属有较强抗性的Limnodrilus hoffmeisteri 大量繁殖（见图2~4）,从而大量消耗溶解氧,导致好氧微生物死亡和河水自净能力退化,最终引起水质恶化。由此可见,微生物对环境污染物的变化有很敏感的响应,通过对环境中微生物的监测有助于进一步分析环境污染的变化。     

垃圾渗滤液中有机物对其厌氧氨氧化的影响

为了考察垃圾渗滤液中有机物对其厌氧氨氧化反应的影响,保证晚期垃圾渗滤液的深度脱氮,采用短程硝化SBR联合厌氧氨氧化SBR(ASBR)两级系统处理氨氮为(2 000±100)mg/L、COD为(2 200±200)mg/L的实际晚期垃圾渗滤液进行试验研究.短程硝化SBR运行了100d,亚硝酸盐积累率达到了95%以上.ASBR采用进水逐步加大渗滤液掺入比例的方式进行驯化.实验结果表明,随着掺入比例的增大,进水可降解COD增加到150 mg/L左右时,ASBR的氮负荷速率从1.20 kg/(m3·d)降到了0.28 kg/(m3·d),氮去除速率从1.10 kg/(m3·d)下降到了0.19 kg/(m3·d),表明系统趋于崩溃.当ASBR进水可降解COD再次降低到50 mg/L左右时,系统的厌氧氨氧化菌活性得到了恢复,最大的氮负荷速率和氮去除速率分别达到了1.55和1.20 kg/(m3·d).定量PCR试验表明,当系统的厌氧氨氧化菌活性得到恢复后,厌氧氨氧化菌占全细菌的比例达到了试验期间的最大值1.94%.     

甘薯HXK基因的克隆、组织表达及生物信息分析

通过RT-PCR技术从甘薯的总RNA中克隆得到了全长的己糖激酶基因,测序结果表明HXK(hexokinase)基因编码区长1491bp,编码496个氨基酸,其翻译的蛋白质分子量为53.4kD,其氨基酸序列与其它已知高等植物HXK基因具有很高的同源性.构建了原核表达载体pET-HXK,经IPTG诱导后可表达获得相对分子量约为71kD的外源融合蛋白,与预测结果一致.并对HXK基因在不同组织中的转录水平进行了数字表达谱和荧光定量分析.     

肝内胆管结石和胆汁中细菌多样性分析

运用培养法和聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对6个病人肝内胆管结石和胆汁中的细菌群落进行了分析.胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养法结果显示,从6个胆石和5个胆汁样品中分别分离到15株和12株细菌,均属于Escherichia和Enterococcus两个属,而同一病人胆石及胆汁中细菌种类并不完全相同,其中一份胆汁样在两种方法检测中皆为阴性;PCR-DGGE结果表明,胆石及胆汁样品中除培养法中发现的两个属外,还包含Pseudomonas、Morganella、Citrobacter、Baterioides、Serratia、Clostridiales和Aeromonas共7个属的细菌.在5组PCR阳性的胆石和胆汁的DGGE指纹图谱相似性分析中,每组内胆石和胆汁间细菌群落结构的最高相似性仅为32.3%.两种检测方法的结果表明,Escherichia coli在胆石和胆汁中的检出率最高,胆石和胆汁中细菌多样性存在差异,PCRDGGE技术比培养法能更好检测到胆石和胆汁中的细菌多样性.