桑泛素基因的克隆和表达

根据桑(Morus bombycis)泛素基因编码区的序列(DQ839402.)设计特异引物,用RT - PCR方法克隆桑泛素基因的编码区.序列分析表明,该编码区长240 bp,编码79个氨基酸,软件分析推测编码蛋白的相对分子量和等电点分别为8.74 kD和7.16.通过同源建模获得了桑泛素基因编码蛋白的理论三维结构.将桑泛素基因与pET - 32a(+)连接,构建原核表达载体pET - 32a - ub,经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3) 中获得高效表达,并经western bolt 印迹证明实现了原核表达,为进一步研究其作用机理奠定基础.     

大豆GmNF-YA8的生物信息学及盐胁迫表达分析

本实验对大豆GmNF-YA8基因进行了生物信息学分析和高盐胁迫下表达量的检测.GmNF-YA8位于大豆基因组9号染色体上,cDNA全长1121 bp,开放阅读框615bp,编码204个氨基酸.GmNF-YA8蛋白分子量22.7 kD,pI 6.16.GmNF-YA8蛋白氨基酸序列中含有1个CBF保守结构域.GmNF-Y...     

野桑蚕Ras 2基因的cDNA分子克隆及其特征

基于家蚕(Bombyx mori)Ras2基因的cDNA序列设计引物,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆了野桑蚕(Bombyx mandarina)Ras2基因,得到的cDNA序列长631bp,含有一个603bp的完整开放阅读框,由2个外显子和1个内含子组成,编码一个由200个氨基酸残基组成的蛋白质.该蛋白质的等电点为6.33,分子量为22.866kD.其氨基酸序列与其他昆虫Ras2氨基酸序列的同源性较高,且具有它们Ras2基因的典型特征.组织表达谱表明,该基因mRNA在野桑蚕的表皮、马氏管、中肠、脂肪体、丝腺中均有不同程度的表达.     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)糖基转移酶基因的克隆、序列分析及表达

为获得具有催化活性的糖基转移酶纯酶,本研究以短小芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用简并PCR技术扩增到基因(GT-A)全长序列.该序列全长1 287bp、编码423个氨基酸,分子量约为49.2KD.经序列分析,该基因属于糖基转移酶基因.根据GT-A基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达重组质粒GTA-pet28a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个约50kD的融合蛋白.纯化后测定其糖基转移酶活性,与37℃相比,80℃的反应温度其活性能提高3.4倍左右.研究结果表明,该酶是一种具有应用潜力的嗜高温糖基转移酶.     

茂原链霉菌谷氨酰胺转胺酶基因克隆、序列分析及原核表达

以茂原链霉菌(Streptomyces m obaraensis)的基因组DNA为模板,利用PCR的方法扩增出谷氨酰胺转胺酶(Transglutam inase,TGase)的完整基因片段.序列分析结果表明,该片段全长1 246 bp,包含一个完整的ORF,长度1 146 bp,编码395 aa,分子量为44 kD左右.该基因的核酸序列及推导的氨基酸序列同已知微生物来源的若干TGase相比,序列相似性均很高,并且发现与酶催化活性有关的一些motif,如酰胺化位点等;在此基础上,又进一步对其二级结构进行分析并完成了TGase三维结构的建模.将编码TGase酶的基因片段插入到原核表达载体pQE30Xa中,并转化大肠杆菌(E.coliJM109).SDS-PAGE结果表明,经IPTG诱导后该基因得到表达,表达产物的酶活为2.2 U/mL.     

甘蓝型油菜Tic21基因克隆、表达及拷贝数鉴定

根据拟南芥Tic21基因编码区设计引物,在甘蓝型油菜中扩增并克隆到其cDNA同源基因,命名为BnTic21(GenBank登录号HQ613273),测序结果显示该基因含有5个外显子,4个内含子,cDNA编码区大小为885 bp,编码294个氨基酸,蛋白理论分子量约为31.24kD,等电点11.10.与拟南芥、豌豆等物种氨基酸序列相似性在60.40%～87.75%之间.实时定量PCR对其不同组织特异性表达分析表明:BnTic21在油菜不同部位均有表达,茎尖最高,子叶、真叶、下胚轴次之,根表达量最低.用实时定量PCR检测表明BnTic21在甘蓝型油菜基因组中约有2个拷贝.     

短小芽孢杆菌(Bacillus p umilus )糖基转移酶基因的克隆、序列分析及表达

为获得具有催化活性的糖基转移酶纯酶,本研究以短小芽孢杆菌基因组 DNA 为模板,利用简并PCR 技术扩增到基因(GT‐A )全长序列.该序列全长1287 bp 、编码423个氨基酸,分子量约为49.2 KD .经序列分析,该基因属于糖基转移酶基因.根据 GT‐A 基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达重组质粒GTA‐pet28a ,并在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功诱导出了一个约50 kD 的融合蛋白.纯化后测定其糖基转移酶活性,与37℃相比,80℃的反应温度其活性能提高3.4倍左右.研究结果表明,该酶是一种具有应用潜力的嗜高温糖基转移酶.     

At3g13600截短型蛋白的原核表达载体的构建

拟南芥基因At3g13600编码一种钙调素结合蛋白,序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 818 bp,编码一个具有606个氨基酸残基的多肽,推测分子量为68.9 kD;在At3g13600蛋白的N端存在IQ钙调素结合构象.为了从实验上进一步研究该蛋白的钙调素结合特性,通过逆转录聚合酶链式反应( RT-PCR)扩增含...     

一个麻疯树C2H2型锌指蛋白基因JcZFP1的克隆与表达分析

从麻疯树胚乳cDNA文库中克隆得到一个C2H2型锌指蛋白基因,JcZFP1,全长931bp,开放阅读框全长735bp,编码244个氨基酸残基,等电点pI=7.0,分子量PA=27.38kD.C2H2型锌指结构位于第81至103个氨基酸残基中,包括植物锌指蛋白特有的保守氨基酸序列QALGGH.在该基因的顺式作用元件上发现了与生长发育和逆境胁迫相关的启动元件.荧光定量PCR(qPCR)检测发现,JcZFP1基因在麻疯树各器官中的表达量依次为:绿果皮花叶根茎种仁,且幼嫩器官表达量高于成熟器官;对麻疯树幼苗进行低温、干旱胁迫时,JcZFP1基因的表达量明显增加,表明该基因可能在麻疯树的生长发育及逆境胁迫应答过程中起重要作用.     

黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母中的表达

从黑曲霉eDNA文库中筛选出糖化酶基因,并在酿酒酵母中进行表达．阳性克隆在发酵培养基中培养60h后,产生的糖化酶酶活力达到峰值为4．3U／mL．测定结果显示其糖化酶大小为1908bp,编码636个氨基酸残基组成的蛋白质．酶学性质分析显示该酶的最适反应温度为50℃,pH为5．0．经柱分离纯化其发酵上清液后,SDS-PAGE电泳方法,测得它的分子量大约为70kD,且条带清晰．     

麻疯树基因JcKNOX1的克隆和表达调控分析

KNOX同源异型盒基因在植物生长发育中扮演着极其重要的角色,首次从大戟科植物麻疯树cDNA中克隆到一个同源异型盒基因,命名为JcKNOX1.其开放阅读框全长693bp,编码230个氨基酸残基,预测蛋白质等电点pI=6.13,分子量PA=25.92kD.聚类分析表明,JcKNOX1与毛白杨在进化上具有最近的亲缘关系,其次是甜橙.荧光定量PCR检测发现,JcKNOX1基因在麻疯树植株各个器官中均有表达,幼嫩部位表达量明显高于成熟器官,表达量依次为:茎尖嫩叶茎叶花叶柄根;对麻疯树幼苗进行ABA和低温胁迫发现,JcKNOX基因表达量明显增加.上游调控元件预测分析表明,该基因可能在麻疯树光调节、激素调控、花粉基因特异性表达、逆境调控等重要生物学过程中具有重要作用.     

粟酒裂殖酵母麦芽糖酶基因的克隆及在大肠杆菌内的表达

利用PCR的方法，以粟酒裂殖酵母菌的染色体DNA为模板，扩增得到粟酒裂殖酵母的结构基因，其开放阅读框1740 bp的序列，可以编码579氨基酸，分子量为67.7 kD.利用NCBI对它的蛋白序列进行比对，发现这个蛋白序列与Aspergillus oryza、Candida albicans、Hansenula polymorpha、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces pastorianus的麦芽糖酶相比分别具有40.6%、41.6%、37.9%、34.7%、34.5%的相似性.而与粟酒裂殖酵母的α-葡萄糖苷酶具有99.8%的相似性，由此可以得出克隆得到的结构基因应该是粟酒裂殖酵母的麦芽糖酶结构基因.将克隆的粟酒裂殖酵母的麦芽糖酶基因克隆到pQE30表达载体中在大肠杆菌中进行诱导表达，然后测定其麦芽糖酶的活力，其酶的比活力是野生菌株的21倍，诱导条件下麦芽糖酶的比活力是非诱导条件下的10倍.     

粗毛栓菌atp9基因的克隆、表达及序列分析

ATP合酶是生物体内能量代谢的关键酶,参与多种氧化磷酸化和光合磷酸化反应.atp9基因是ATP合酶的重要组成部分,其编码了ATP合酶A亚基上第9亚单位,与呼吸作用和光合作用密切相关.本研究利用atp9基因在进化过程中高度保守的特点,据已知近缘真菌基因序列,设计并合成了一对引物,以粗毛栓菌mRNA反转录得到的cDNA第一链为模板,PCR扩增得到atp9基因完整序列,并连接于原核表达载体pET32a(+)上.测序与序列分析表明:该克隆片段全长222 bp,共编码73个氨基酸,翻译的蛋白质分子量是7.35 kDa.转化大肠杆菌后经IPTG诱导,可高效表达外源融合蛋白,分子量大小与预测结果一致.经过同源比对和进化树分析,该克隆基因编码的氨基酸序列与可可丛枝病菌(Crinipellis perniciosa)和瓣环栓菌(Trametes cingulata strain ATCC 26747)中相对应的氨基酸序列相似度最高.本实验为未来进一步研究粗毛栓菌atp9基因和其蛋白功能,阐明其调控和作用机制奠定了基础.     

野桑蚕漆酶基因克隆、序列分析及转录表达谱研究

利用RT-PCR方法,克隆了野桑蚕Bombyx mandarina漆酶基因,获得了其cDNA序列.该序列长2 317bp,含有一个2 295bp的完整开放阅读框,有8个外显子,7个内含子,编码一个由764个氨基酸残基组成的蛋白质,其蛋白质的分子量和等电点分别为84 340.91和6.61.推导的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫(Laccase)基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的漆酶基因所共有的典型特征.组织特异性表达分析表明了该基因仅在野桑蚕的表皮、头部、中肠和血液中有表达.这些结果为进一步研究野桑蚕漆酶基因的功能提供了分子基础.     

野桑蚕Ras1基因的cDNA克隆及转录表达谱研究

采用RT-PCR的方法,克隆了野桑蚕Bombyx mandarina Ras1基因,获得了其cDNA序列.该序列长640bp,含有1个579bp的完整开放阅读框,有2个外显子,1个内含子,编码1个由192个氨基酸残基组成的蛋白质,其蛋白质的分子量和等电点分别为21 800和6.24.推导的氨基酸序列与其它物种Ras1基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的Ras1基因所共有的典型特征.组织特异性表达分析表明该基因在野桑蚕的丝腺、脂肪体、表皮、中肠和马氏管中均有表达.这些结果为进一步研究野桑蚕Ras1基因的功能奠定了分子基础.     

淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白1.3 kb基因片段的原核表达

取淋巴囊肿病病毒感染牙鲆组织,蛋白酶K裂解,PCR法成功获得了淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白1.3 kb基因片段.构建其原核表达载体,IPTG诱导表达.结果表明,该融合蛋白分子量约70 kD,可与抗LCDV多克隆血清特异反应.为LCDV基因工程疫苗的研制奠定了实验基础.     

一个与油菜黄化相关的未知功能基因克隆及表达

以构建的油菜幼叶黄化突变体Cr3529消减文库中一个未知功能的差异表达基因片段为基础,应用RACE-PCR技术,扩增并克隆到两个cDNA全序列,分别命名为BnCr4和Bn-Cr4-1.测序结果显示,BnCr4编码区序列大小为1395 bp,编码465个氨基酸,而BnCr4-1编码区序列长1311 bp,编码437个氨基酸.BLAST结果表明它们与拟南芥中的一个未知功能基因的cDNA同源性分别为87%和80%.功能预测显示它们含有与蛋白质的修饰作用有关的多个活性位点,如磷酸化、糖基化、酰胺化以及磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,可能是一种新的与cAMP介导的蛋白质磷酸化与去磷酸化作用有关的蛋白.Northen杂交结果显示该基因在Cr3529子叶期和幼叶期的表达高于野生型油菜,显示该基因的表达与突变性状紧密相关.最后,原核表达了BnCr4,得到了与预计分子量相同的融合蛋白.     

葱蝇己糖激酶基因的鉴定、特征分析及在滞育期的表达分析

基于转录组数据,首次鉴定了葱蝇(Delia antiqua)2条己糖激酶(Hexokinase,HXK)基因分别命名为Da HXK-1和Da HXK-2。Da HXK-1基因含有1 544 bp的开放阅读框,编码513个氨基酸,相对分子量和理论等电点分别为58.3k D和5.97;Da HXK-2基因的开放阅读框为2 512 bp,编码819个氨基酸,相对分子量和理论等电点分别为91.1 k D和9.19,二者编码的蛋白同为胞质型蛋白,具有该酶蛋白质典型的保守结构域,且与家蝇(Musca domestica)Md HXK-1和Md HXK-2蛋白的同源性分别为74%和78%;系统发育分析显示它们与其他双翅目(Diptera)昆虫的己糖激酶的进化关系最近,表明己糖激酶在进化过程中比较保守。基因表达分析显示Da HXK-1和Da HXK-2基因在夏滞育蛹中都下调表达;Da HXK-1基因在冬滞育蛹中的表达呈先上升后下降趋势,Da HXK-2基因的表达模式则相反。研究认为Da HXK-1和Da HXK-2基因的不同表达模式可能与组织特异性有关。
     

西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物外壳蛋白(CP)基因,大小为843 bp.将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%~95.0%和96.5%~98.6%.将CP基因定向插入EcoR I/SalI切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为37 kD的CP蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4 h后蛋白开始表达,8 h后表达量比较大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与CP发生血清学反应.     

红斑丹毒丝菌C43065株spaA基因的克隆和表达

通过PCR从红斑丹毒丝菌C43065株基因组DNA中扩增出编码信号肽除外的成熟SpaA蛋白基因spaA,将其克隆到表达载体pET32a的BamHⅠ和Hind Ⅲ位点上,构建重组表达质粒pET-spaA,转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达N端带有Trx标签的融合蛋白rSpaA,SDS-PAGE检测表达蛋白.DNA测序结果表明,spaA基因大小为1794 bp,编码由597个氨基酸残基组成的成熟SpaA蛋白,SDS-PAGE结果显示在大肠杆菌BL21中成功表达了分子量约为86 kDa的重组rSpaA,为进一步开展SpaA保护区域的研究奠定基础.