本生烟组织培养及遗传转化体系的建立

本文研究了通过农杆菌侵染获得本生烟(Nicotiana benthamiana)转基因植株的方法。将本生烟中上部叶片消毒后切成5mm×5mm左右的小块作为外植体,在含有6-BA(3mg/L)和NAA(0.2mg/L)的MS培养基中培养2~3d,用含有表达载体的农杆菌侵染后共培养3~4d,转入含有6-BA(3mg/L)、NAA(0.2mg/L)和卡那霉素(100mg/L)的MS培养基中培养2~3周。将外植体边缘产生的愈伤组织和芽点转移到只含有卡那霉素(100mg/L)的MS培养基中继续培养,2周后分化出大量不定芽。继续培养2周,当芽长1~3cm时,将芽转移到含IBA(0.1mg/L)的MS培养基中分化生根,得到再生植株。当再生植株高8~10cm、根长4~5cm以上时,移栽到经过灭菌的营养土中。通过实时荧光PCR扩增,从获得的植株中检测35S启动子和NOS终止子外源基因片段,判定所得的植株的确为转基因植株。最后对本生烟组织培养中应该注意的问题进行了讨论。     

双链置换探针实时PCR用于DNA池的等位基因频率测定

结合荧光双链置换探针的特异性和实时PCR的准确定量能力,建立了一种新颖、准确、价廉且高通量的测定DNA池等位基因频率的方法.该方法采用不同荧光标记的双链置换探针1次PCR反应即可测定出等位基因频率.实验以β 地中海贫血CDs41 42( TCTT)突变为对象,分别用荧光染料FAM和ROX标记野生型和突变型探针,由实时PCR检测建立的等位基因浓度与循环阈值的响应曲线计算DNA池的等位基因频率.结果表明,建立的系列等位基因浓度与循环阈值呈线性关系,线性相关系数分别为0.9977(野生型等位基因)和0.9938(突变型等位基因),可检测的最低等位基因频率达1%,等位基因频率在1%～90%范围内测定误差小于4%.该方法可广泛用于流行病学调查、遗传连锁分析以及全基因组连锁不平衡扫描等领域.     

用分子探针探测两种AM真菌在同一宿主植物根内的侵染

两种AM菌根真菌(G．intraradices和G．mosseae)混合接种于同一宿主植物紫云英中，通过Trypan blue染色检测了AM真菌在紫云英根中的存在，并通过nested PCR和特异性的分子探针，探测了Gintraradices和G．mosseae对紫云英同一根段的侵染。     

苏云金芽孢杆菌猝倒亚种Cry1Aa13基因的克隆及序列分析

根据Gen Bank中Cry1A类基因序列设计一对特异性引物，以苏云金芽孢杆茵猝倒亚种质粒DNA为模板，应用PCR扩增技术得到一大小约为3．6kb的DNA片段(Cry1Aa13)．通过引物步行法测定该片段长3598bp，其中开放阅读框(ORF)长3540bp，编码1180个氨基酸，分子量为133．49kD，等电点pI=5．0．序列比较表明该基因与Cry1Aa类基因高度同源(达95％以上)，该基因已在GenBank中登录，登录号为AF510713，并被Btδ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为Cry1Aa13。     

不同破壁方法对活性污泥总DNA提取效果的影响

分别采用酶法、化学法、珠磨匀浆法和反复冻融法对活性污泥样品进行破壁，提取总DNA，并通过提取的核酸总量、纯度、片段分布情况、是否含有聚合酶链反应抑制剂以及基因间隔序列(ITS)扩增产物多态性等5个指标来评价不同的细胞破壁方法对活性污泥总DNA提取效果的影响。结果表明，化学法的优势最明显，提取的总量最多，大片段提取效果好，虽然杂质较多，但不影响聚合酶链反应，方法的偏倚性最小。     

淋巴细胞白血病患者CD3基因表达模式的变化

目的:了解T细胞受体信号传导分子CD3γδεζ基因在T和B细胞白血病病人中的表达特点.方法:采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量分析法检测32例淋巴细胞肿瘤病人:急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)12例、慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)9例、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)11例及10例健康人外周血...     

小鼠骨髓间充质干细胞多潜能性的鉴定

目的:鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的多分化潜能的起因.方法:从成年小鼠骨髓股骨、胫骨中分离MSCs,并进行原代培养,分别于0、2、4、6、8、10 d提取总RNA,通过RT-PCR检测多潜能特征基因和相关因子、3个胚层特征基因的mRNA的表达情况,以判断MSCs的特性.结果:小鼠MSCs中表达多能性标记基因Oc...     

实时定量PCR检测B细胞恶性肿瘤中BCL11A基因的表达水平

目的:建立B细胞淋巴瘤/白血病BCL11A基因的定量检测方法,并分析其在B细胞恶性肿瘤中的表达水平。方法:利用实时定量RT-PCR分析B细胞淋巴瘤(18例)、B细胞性慢性淋巴细胞白血病(B-CLL,8例)、T细胞性急性淋巴细胞白血病(T-ALL,8例)和正常对照(15例)外周血单个核细胞(PBMC)中BCL11A基因的表达水平,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为内对照。结果:B-CLL组和B细胞淋巴瘤组患者PBMC中BCL11A表达水平均明显高于正常对照(P=0.000)和T-ALL组(P=0.000);T-ALL组和正常对照组BCL11A表达水平无显著差别(P=0.084);B-CLL组和B细胞淋巴瘤组BCL11A表达水平无显著差别(P=0.776)。在B细胞淋巴瘤不同的病例中,BCL11A表达水平有较大差异,其中最小值为0.04,最大值为9.70,中位值为1.00。结论:成功建立BCL11A基因的定量检测方法。     

利用PCR-DGGE技术鉴定硝基甲苯类物质降解菌株

为鉴定光催化-厌氧好氧固定化微生物方法降解2,6-DNT和4-MNT的优势菌株,取连续运行40d的厌氧好氧反应器出入口的微生物样品.采用PCR-DGGE技术分离微生物,得到对2,6-DNT和4-MNT具有良好降解特性的优势菌种;发现厌氧反应器内不同位置微生物种类差别很大,好氧反应器内差别很小;反应器内有5种优势菌株:Delta proteobacterium,Pseudomonas stutzeri,Pseudomonas trivialis,Burkholderia cenocepa-ciaand Chryseobacterium sp.AKB-2008-VA6和1个未知菌株,以兼性厌氧和好氧方式生存.反应器运行期间,水质指标良好.