猪胆囊收缩素-33基因同向四串联体的构建与表达

根据GenBank上公布的猪胆囊收缩素（choleystokinin, CCK）-33基因的cDNA序列设计特异引物，以猪十二指肠cDNA为模板，PCR扩增得到CCK33基因，并克隆入pMD18-T载体，利用引物中设计的一对同尾酶构建CCK33四串联体，并在大肠杆菌中成功表达.表达纯化蛋白制备抗原，得到多克隆抗体.Western blot显示重组蛋白具有良好的免疫原性.     

αB-晶状体蛋白CRYAB基因重组表达载体的构建及分子生物学鉴定

目的:构建人晶状体蛋白CRYAB基因与真核表达载体pIRES2-DsRed-Express的重组体,为研究人晶状体蛋白CRYAB基因的功能奠定基础.方法:根据人晶状体蛋白CRYAB基因的核苷酸序列,设计并合成分别带有酶切位点的引物,从pMD 18T-CRYAB基因克隆载体中扩增出CRYAB基因外显子片段,与载体pIRES2-DsRed-Express连接构建人晶状体蛋白CRYAB基因的表达载体,转化入大肠杆菌DH5α中.经抗生素筛选阳性克隆,通过酶切图谱分析、菌落PCR和测序鉴定所构建的表达载体.结果:构建的载体经PCR、酶切鉴定和测序证实插入方向正确,表达阅读框正确,载体构建成功.结论:重组人晶状体蛋白CRYAB基因表达载体的构建为研究CRYAB基因的功能及进一步研究先天性白内障的发病机制奠定了基础.     

干酪乳杆菌同源整合载体的构建与鉴定

构建乳酸菌同源重组载体,以实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达。PCR扩增lacZ基因表达盒lacZ-cassette,和upp基因表达盒upp-cassette,SOE-PCR扩增lacZ-P-upp,产物回收后连接到pORI28载体中,构建载体pORZP;根据干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393全基因组中lai基因序列设计引物,PCR扩增lai基因两端同源重组臂lai-up和lai-down基因序列,产物经回收后,连接至pORZP载体中,得同源重组载体pORZPlai。双酶切及DNA测序结果证实,成功构建了同源重组载体pORZP-lai,为实现外源基因在乳酸菌中的非抗性、整合型表达奠定了基础。     

实时荧光定量PCR检测多鳍鱼Shh基因表达标准品质粒和标准曲线的构建

为了快速、准确定量多鳍鱼Shh基因在机体组织中的表达水平,根据笔者克隆的Shh基因序列,选择其高度保守区域设计一对引物,对多鳍鱼各组织提取mRNA,经RT-PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌DH5α。筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行酶切、PCR和测序鉴定,表明Shh基因保守区段已经成功克隆。将重组标准品质粒进行倍比稀释,然后以此为模板,进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系。回归方程为y=-0.32x 10.47,回归系数为1.00。构建Shh基因表达检测标准品质粒和标准曲线,建立检测多鳍鱼Shh基因荧光定量PCR方法,为进一步研究Shh基因在组织中的动态分布和研究多鳍鱼系统发育奠定了基础。     

PCR法快速鉴定阳性克隆实验的改进

分析了常规PCR扩增鉴定阳性克隆实验中存在的问题,进行了改进探索:反转录PCR(RT-PCR)获得目的基因片段,TA克隆连接质粒载体、转化大肠杆菌感受态细胞;利用目的基因的特异性引物,用菌液PCR法直接筛选重组克隆,在筛选的阳性菌液中扩增到与目的基因片段大小一致的阳性条带,与质粒PCR及酶切的阳性对照一致,验证了菌液PCR具有可靠性。实验证明,自身引物菌液PCR法用于定性筛选重组阳性克隆,是一种简便、快速、有效的方法。     

重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因及其重组质粒构建

目的:利用重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因的全长序列.方法:对风疹E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化;设计多对寡核苷酸引物,以重叠PCR法分别合成该基因的3个片段,测序鉴定后以酶切连接法将各段拼接成全长为1 443 bp的RV rE1,将E1基因的全长序列克隆导入原核表达载体pET32a.结果:分别进行8轮、5轮和6轮的重叠PCR扩增,合成风疹基因3个片段;以酶切连接法将3个片段拼接成全长rE1基因并克隆入pET32a构建成载体pET32-RV rE1,PCR、酶切和测序鉴定结果表明,合成的E1基因大小、序列与预期相符;构建获得重组质粒pET32-RV rE1.结论:成功合成了密码子优化的风疹病毒E1基因并构建其重组质粒pET32-RV rE1.     

串联表达载体中短重复序列(BmKb1)_n模板的PCR效率及其优化条件研究

采用Overlap PCR法获取BmKb1基因,构建载体pGEX-6p-1/BmKb1,同尾酶技术用于构建串联表达载体pGEX-6p-1/(BmKb1)n(n=2,4,6,8,10)。以pGEX-6p-1/(BmKb1)n为模板,使用标准PCR程序研究短重复序列PCR效率;以BmKb1八倍体为模板,分别研究PCR循环数、引物终浓度及退火温度对短重复序列PCR效率及特异性的影响。结果表明:串联重复序列数目增加,则非特异性条带增加,特异性条带含量减少;BmKb1基因串联体PCR扩增在18～20循环数、引物终浓度为0.05～0.1μM、60～62℃较高退火温度时,可获得相对高产量高特异性BmKb1基因串联体PCR片段。本研究将为串联表达载体克隆、筛选、测序及基因组STRs序列克隆测序提供技术参考。     

人类胰岛素基因的克隆及其真核表达载体的构建

从胎儿胰腺细胞中提取出总RNA作为模板,用特异性引物和RT-PCR法扩增INS基因的cDNA,PCR产物T-A克隆到T载体构建中间重组体pUC57-INS,其测序结果和Genbank公布的序列一致。HindIII和BamHI双酶切pUC57-INS后,将INS基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,经PCR扩增、酶切分析和序列测定后证实了重组表达质粒pEGFP-N1-INS构建成功。这将为转人类胰岛素基因动物模型的建立及人类糖尿病的基因治疗奠定必要的基础。     

对虾白斑病毒VP28基因在聚球藻中的表达与分析

通过PCR从实验室保存的pMD-VP28质粒中扩增得到对虾白斑病毒囊膜蛋白VP28基因,同时在设计的引物起始密码子前添加促进外源基因在蓝藻中表达的SD序列,引物末端添加限制性内切酶住点BamH I和EcoR I,从质粒pRL-439获得强启动子PpsbA,酶切连接构建了pDC-VP28高效表达穿梭裁体.利用三亲接合转移成功地将构建的栽体pDC-VP28转化聚球藻7002.对转基因聚球藻进行培养,其表达产物通过SDS-PAGE分析,发现表达量达3%左右.     

白藜芦醇合酶基因的克隆及对毕赤酵母的转化

目的建立白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统。方法通过PCR、限制性内切酶消化、连接、电激等方法,构建表达载体,转化毕赤酵母GS115。结果从葡萄基因组DNA中扩增得到了 1 200 bp目的基因,并克隆至pBS-T栽体;成功构建了表达载体pPIC3．5K／RS;目的基因成功整合进毕赤酵母GS115基因组中。测序及PCR鉴定证明,白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统建立成功。结论所得方法无需高质量的RNA,从而降低了试验条件,达到了快速简便的目的。     

Total synthesis of a human leukocyte interferon gene

A 514-base pair fragment of double-stranded DNA coding for human interferon-alpha 1 (166 amino acid residues), and containing initiation and termination signals plus appropriate restriction enzyme sites for plasmid insertion, has been totally synthesized. The synthesis involved preparation of 66 oligodeoxyribonucleotides, ranging in size from 14 to 21 residues, plus 1 deoxydecanucleotide, by rapid, solid phase procedures, and enzymatic ligation of the oligonucleotides. After ligation of the synthetic gene to a plasmid vector and transformation of Escherichia coli, clones containing the anticipated gene sequence were obtained.     

bFGF真核表达载体构建及表达

旨在构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor,简称bFGF）的真核表达载体，以便用于研究bFGF基因治疗在骨组织工程中的应用，应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1上，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况，酶切，PCR和DNA测序结果均证实了插入片段的正确性，免疫组织化学检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结果表明已成功构建了bFGF真核表达载体pcDNA3.1-bFGF，并且bFGF能够在3T3细胞表达。     

基于二次规划的无监督支持向量机

支持向量机在分类中的推广能力是非常显著的.通过构造目标函数和约束条件,借助二次规划模型提出了一种无监督支持向量机,它能在聚类的同时求出最优分类超平面并保证了支持向量机的推广能力.     

基于向量投影的多目标决策模型在工程评标中的应用

评标是招标过程的重要环节,评价方法较多.在建立评标指标体系的基础上,通过构建指标评价函数和语言评价集,分别采用层次分析和模糊决策方法,计算各标书指标向量在理想方案向量上的投影值,作为业主满意度,并以此来评价各方案的优劣.     

二次精度参数插值曲线的构造

提出了一种构造三次参数曲线对给定数据点插值的新方法。该方法不同于现有的许多参数曲线构造方法,其构造参数曲线没有选择节点的过程,而是在每2个数据点之间构造一条单位区间上的三次埃尔米特插值曲线段,所有曲线段拼合在一起形成整体的插值曲线,该方法的关键是计算每个数据点处的导矢。对每个数据点,该方法使用5或4个数据点构造一条二次多项式曲线,数据点处的导矢由二次多项式曲线的导矢近似。该方法构造的三次参数曲线具有二次多项式精度。并以以实例对新方法与其它方法构造的插值曲线的精度进行了比较,结果表明,新方法构造的插值曲线的精度较高。     

不用接头进行异末端DNA重组的方法

用过渡载体通过两次重组进行不同粘性末端之间的ＤＮＡ重组。该方法不需要替换接头，从而省去昂贵的试剂和平末端连接这种较难的操作。即经济，简单又有效，易于操作。     

基于VAR模型的中国居民消费与经济增长的关系

为研究我国城镇、农村居民消费与经济增长之间的关系,采用我国1978—2008年的经济数据,在构建稳定的VAR模型基础上,通过建立协整方程,运用Granger因果检验方法、脉冲响应函数和方差分解方法,对其进行分析.结果表明:短期内农村居民消费对我国经济增长的拉动明显,长期内城镇居民消费对经济增长有较强的促进作用;城镇居民消费和农村居民消费都是经济增长的强Granger原因,农村居民消费的冲击会影响城镇居民消费,间接地对经济增长的波动产生较大影响.     

基于蚁群算法的复杂疾病上位性分析方法

针对全基因组规模的上位性分析中存在的问题,首先采用基于多准则融合的过滤法对大量变异位点进行筛选以过滤无关位点,并结合蚁群算法对变异位点进行上位性分析,从而进一步剔除冗余位点,最后采用支持向量机作为上位性与复杂疾病关系的分类模型.实验结果表明,先过滤再分类的策略,不仅大大降低了上位性时间复杂度,并且在分类准确度上也有一定程度提高.