小分子靶向受体酪氨酸激酶抑制剂TW9183的合成及体外抗肿瘤活性

合成一系列喹啉类衍生物,初步筛选出候选药物TW9183,并对其体外抗肿瘤活性进行研究.4,7-二氯喹啉通过亲核取代、酰氯化及缩合反应得到TW9183.采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)、平板克隆、划痕法、Hoechst 33342染色、蛋白免疫印迹及流式细胞术研究TW9183对3种人类肿瘤细胞(Hela,A549,SMMC-7721)的体外抑制作用.产物结构经红外光谱、核磁共振氢谱、碳谱、电喷雾质谱和元素分析表征确证.实验结果表明:TW9183能有效抑制3种肿瘤细胞的增殖,但对正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)无影响;Hoechst染色可见肿瘤细胞凋亡明显;TW9183能促进caspase-3活化形式的表达;划痕实验中肿瘤细胞迁移能力显著下降;流式细胞术表明其能将3种肿瘤细胞阻滞于G2/M期.     

绿豆胰蛋白酶抑制剂BBI诱导肺腺癌A549细胞凋亡的研究

研究了绿豆胰蛋白酶抑制剂BBI对人肺腺癌A549细胞增殖抑制作用和对肺腺癌A549细胞凋亡的影响.采用MTT法检测绿豆BBI对人肺癌A549细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测和光镜观察绿豆BBI诱导A549细胞凋亡;Western-Blot检测凋亡蛋白Caspase3表达情况.结果显示:绿豆BBI对人肺腺癌A549细胞的增殖有明显抑制作用;绿豆BBI可以促使人肺腺癌A549细胞出现明显的染色质浓缩和凋亡小体,诱导人肺腺癌A549细胞的凋亡.说明绿豆BBI能抑制人肺腺癌A549细胞增殖、诱导人肺腺癌?A549细胞凋亡,实验为绿豆BBI抗肿瘤效应提供了依据.     

重组绿豆胰蛋白酶抑制剂片段对肠癌细胞SW480迁移的影响

探讨重组胰蛋白酶抑制剂活性片段(LysGP33)的抗肠癌效应.大肠杆菌原核表达LysGP33活性片段,GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化.MTT比色和细胞划痕方法检测LysGP33活性片段对SW480细胞增殖和迁移的影响.结果表明:10 μmol/L LysGP33活性片段对SW480细胞的增殖活性无明显影响,但能够有效地抑制SW480细胞的迁移,并呈现时间依赖效应.绿豆胰蛋白酶抑制剂抑制了肠癌细胞的迁移,在抗肿瘤浸润和转移中具有一定的应用前景.     

TRAIL与kallistatin联合表达载体的构建及抗肿瘤活性分析

为研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与组织激肽释放酶结合蛋白(kallistatin)联合用药的抗肿瘤作用,构建TRAIL与kallistatin双表达的重组质粒pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL,将重组质粒转染A549,LO-2,NCI-H446和Hela细胞,考察其抗肿瘤活性.实验结果表明:构建的双表达载体能同时表达TRAIL与kallistatin,且均能分泌至培养基中;TRAIL与kallistatin联合表达对肿瘤细胞活力的抑制作用明显增强,诱导肿瘤凋亡的作用也明显增强,说明联合表达TRAIL与kallistatin能够增强抗肿瘤活性.     

对香豆酸抑制肺癌细胞增殖、迁移并诱导其凋亡的机制研究

探究了对香豆酸（p-coumaric acid,p-CA）对人肺癌细胞细胞A549和H1299增殖、凋亡和迁移的影响及作用机制.结果显示,添加0～10 mM p-CA能显著抑制两种肺癌细胞的生长和迁移,并呈剂量和时间依赖性（P<0.001）. p-CA显著抑制了细胞周期发生,并将细胞周期阻滞在G1期,且细胞凋亡发生明显增加（P<0.05）. p-CA显著抑制了CDK2、CDK6、Cyclin D1等周期正调控因子表达,并诱导细胞周期负调控因子p21、p27等基因的表达上调;与此同时,p-CA还诱导了促凋亡因子Bax表达上升和抗凋亡因子Bcl-2表达水平的降低且caspase-3和caspase-9的表达上调,而对迁移相关基因表达的检测结果也显示p-CA抑制了β-连环蛋白（β-catenin）的表达并促进钙粘附蛋白E(E-cadherin)表达上升.上述结果表明,p-CA具有抑制肺癌细胞生长、诱导凋亡并抑制其迁移的作用,它主要是通过促进Bax、caspase-3、caspase-9、p21、p27、E-cadherin等蛋白的表达而抑制Bcl-2、Cyclin D1、β-ca...     

荔枝核提取物对HepG-2细胞生长抑制及凋亡诱导机制的探讨

目的:探讨荔枝核提取物成分L2.3对人肝癌细胞HepG-2的生长抑制作用及其分子机制.方法:MTT法测定样品对HepG-2细胞的增殖抑制,荧光染色观察细胞凋亡;比色法检测样品对HepG-2中caspase-3、caspase-8和caspase-9活性的影响,流式细胞仪检测并分析Fas蛋白表达的变化.结果:L2.3对HepG-2细胞表现出时间及剂量依赖性增殖抑制活性(P<0.05),其半数抑制质量浓度为43.0 μg/mL;处理组细胞中出现致密浓染亮蓝色凋亡小体.较高质量浓度的L2.3处理细胞后,caspase-3、8、9的活性均呈时间依赖性增高(P<0.01),且Fas蛋白的表达也明显上调(P<0.05).结论:荔枝核提取物L2.3对HepG-2细胞有体外增殖抑制活性,并介导 caspase-3、caspase-8、caspase-9活性改变及Fas蛋白表达的上调,以此诱导细胞凋亡的发生.     

肺癌小鼠肿瘤组织IL-10的来源及其功能验证

为了解肺癌肿瘤组织白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)的表达和来源，并探究IL-10对肿瘤的作用，采用MSD超敏电化学发光技术检测Lewis肺癌小鼠模型血清中IL-10的水平，使用流式细胞术分析肿瘤组织IL-10的主要来源，再通过CCK-8实验、膜联蛋白V-碘化丙啶(annexin V-PI)凋亡实验、划痕实验，检测IL-10重组蛋白对肺癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响。结果表明：Lewis肺癌小鼠血清中IL-10水平较正常小鼠显著升高，肿瘤组织中的IL-10主要由免疫细胞产生。其中，B细胞和髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是IL-10的主要来源，IL-10重组蛋白可以显著抑制LLC(小鼠Lewis肺癌细胞：Lewis lung carcinoma line)的增殖和迁移并促进其凋亡。综上可见，IL-10水平与肺癌密切相关，B细胞和MDSCs是产生IL-10的主要来源，IL-10可能通过激活CD8 T细胞或者直接作用于肿瘤细胞而发挥抗肿瘤作用。     

1,8-萘二甲酰亚胺衍生物NA-17对肝癌细胞株HepG2的体外抗肿瘤作用研究

本文对1,8-萘二甲酰亚胺衍生物NA-17(N-(3,4-亚甲二氧苯乙基)-4-(3-N,N-二甲氨基)丙胺基-1,8-萘二甲酰亚胺)在肝癌细胞中的抗肿瘤活性进行了研究。对多种肿瘤细胞的抗肿瘤活性筛选表明NA-17对肿瘤细胞具有一定的选择性,其中对肝癌细胞(HepG2)有较好的抑制效果,但对正常肝细胞(HL-7702)毒性较低。初步的机制研究显示,NA-17通过诱发HepG2细胞发生早期凋亡杀死HepG2细胞,但对细胞周期无明显影响,进一步的分子机制研究表明NA-17通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表达,同时上调凋亡蛋白Bak的表达,从而诱导HepG2细胞发生细胞凋亡。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂BBI诱导肺腺癌A549细胞凋亡

研究了绿豆胰蛋白酶抑制剂BBI对人肺腺癌A549细胞增殖抑制作用和对肺腺癌A549细胞凋亡的影响.结果显示:绿豆BBI对人肺腺癌A549细胞的增殖有明显抑制作用,绿豆BBI可以促使人肺腺癌A549细胞出现明显的染色质浓缩和凋亡小体,诱导人肺腺癌A549细胞的凋亡.说明绿豆BBI能抑制人肺腺癌A549细胞增殖、诱导人肺腺癌A549细胞凋亡,为绿豆BBI抗肿瘤效应提供了依据.     

新型姜黄素结构衍生物抗肝癌细胞增殖作用的研究

采用MTT法对姜黄素结构衍生物（CCM系列化合物）进行抗人肝癌细胞Bel-7402和SMMC-7721活性筛选;利用流式细胞技术和荧光显微镜检测SMMC-7721细胞凋亡及周期分布;采用Western-Blot方法检测SMMC-7721中蛋白caspase-3和剪切后p17的表达.结果表明,化合物CCM-5和CCM-14抗肿瘤活性较好,其对SMMC-7721细胞的凋亡作用呈剂量依赖性,且凋亡率与阴性对照组相比有显著差异（P<0.01）;化合物浓度增高时,G0/G1期细胞减少,S期以及G2/M期细胞增加,凋亡峰SubG1峰增大;两个化合物均可增强caspase-3的表达,随着浓度的提高,caspase-3的表达趋势减弱,而剪切形式p17亚基表达量逐渐提高.因此,姜黄素结构衍生物CCM-5和CCM-14能抑制人肝癌细胞SMMC-7721细胞的增殖,促进凋亡,其作用机制可能与化合物诱导caspase-3活性的增强有关.     

凋亡素融合蛋白在HeLa细胞中的转导及体外活性分析

研究胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)的肝素结合域(HBD)在HeLa细胞中的转导活性,并证实HBD具有运载药物蛋白(凋亡素)进入细胞并诱导肿瘤细胞凋亡的能力。通过克隆表达的HBD-EGFP融合蛋白经Ni2+-NTA纯化后,观察其转导活性;并利用HBD-凋亡素融合蛋白表达纯化后,用噻唑蓝(MTT法)检测肿瘤细胞的凋亡。结果表明:用荧光显微镜可观察到HeLa细胞内有绿色荧光;MTT法检测表明凋亡素融合蛋白能诱导HeLa细胞的凋亡;HBD具有转导活性,能携带药物蛋白(凋亡素)进入细胞并能诱导HeLa细胞的凋亡。     

Blf-ADT对HeLa细胞的抑制作用及其机制的研究

研究Blf-ADT(布洛芬硫化氢供体物)的抗肿瘤作用,并对其机制作初步探讨.通过形态学观察、噻唑蓝(MTT)比色实验、集落形成实验测定He La细胞的增殖能力;细胞划痕实验测定He La细胞的迁移能力;Annexin VFITC/PI双染流式细胞仪测定He La细胞的凋亡率;Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Erk、P38和Procaspase-3等)的表达.结果显示,Blf-ADT能呈浓度或时间依赖性抑制细胞增殖、减少细胞集落的形成,降低细胞的迁移能力,同时能显著提高He La细胞的凋亡率,影响细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Erk、P38和Procaspase-3等)的表达.Blf-ADT对人宫颈癌He La细胞的生长有显著的抑制作用,对治疗宫颈癌具有潜在的临床应用价值.     

脑特异性高表达蛋白TMEM59L诱导细胞凋亡的机制

TMEM59L为近年来新发现的脑特异性高表达蛋白,具有促凋亡效果,但其具体的凋亡机制还不清楚.构建了TMEM59L重组质粒,并在HEK293T细胞中过表达TMEM59L,用Annexin V-FITC/PI双染法确定了TMEM59L可以诱导细胞凋亡,之后用免疫印迹方法检测细胞内凋亡相关分子激活情况.结果显示,外源TMEM59L可以降低Bcl-2的蛋白表达水平,诱导细胞色素c从线粒体释放进入细胞质,并且激活caspase-9、caspase-7和caspase-3,但不激活caspase-8;活化的caspase-7和caspase-3进一步酶解死亡底物PARP,导致细胞凋亡;此外,用广谱caspase抑制剂Z-Val-Ala-Asp-FMK(Z-VAD-FMK)抑制caspase-7和caspase-3活性后,死亡底物PARP的酶解也基本被抑制.由此可见,TMEM59L是通过caspase依赖的线粒体途径诱导HEK293T细胞凋亡.     

PD-L1表达抑制剂的筛选及其抗肿瘤活性

为了筛选PD-L1启动子活性抑制剂,研究其抑制肿瘤细胞中PD-L1蛋白表达对机体抗肿瘤免疫活性的调节作用.利用荧光素报告基因检测系统对小分子化合物库中的311种化合物进行筛选,发现硫酸长春新碱(vincristine sulfate,VCR)以浓度依赖性抑制PD-L1基因启动子活性.RT-PCR、免疫印迹实验(Westernblot)等生物学评价实验显示:VCR抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞中PD-L1表达以及B16细胞PD-L1蛋白表达和成瘤;VCR增强Jurkat细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤活性,并促进C57BL/6小鼠细胞因子IL-2和γ-IFN的分泌,增强抗肿瘤活性.研究结果表明,VCR通过抑制PD-L1启动子活性下调肿瘤细胞中PD-L1蛋白表达,从而解除PD-1/PD-L1信号通路介导的免疫抑制,增强机体对肿瘤细胞的免疫应答和杀伤作用.     

一种靶向FAP的蛋白疫苗设计及其抗肿瘤保护研究

设计了一种成纤维细胞活化蛋白(FAP)催化结构域与白喉毒素跨膜结构域(DTT)融合的蛋白疫苗并研究了其抗肿瘤保护效果.通过基因重组,构建了FAP催化结构域与DTT的融合蛋白DTT-FAP.融合蛋白经大肠杆菌表达后,由GST柱进行亲和纯化.DTT-FAP免疫Balb/c小鼠后,接种结肠癌CT26实体瘤.ELISA检测血清效价,并研究其抗肿瘤保护效果.DTT-FAP引起了相应的免疫反应,血清效价约5×103.该疫苗显著抑制CT26肿瘤生长(p<0.01),并显著提高小鼠生存率(p<0.01).本研究首次构建了以FAP为靶点的蛋白疫苗DTT-FAP,该疫苗可引起小鼠针对人FAP的免疫反应,并对结肠癌CT26实体瘤有显著抗肿瘤保护效果.     

七鳃鳗口腔腺重组蛋白rLj-RGD3对人肝癌HepG2细胞活性的影响

七鳃鳗口腔腺含有RGD功能基因,为了确认其表达蛋白在抑制肿瘤方面的功能,在前期获得带有组氨酸标签的分子量为14．5 kD 的基因重组蛋白 rLj‐RGD3基础上,研究了不同浓度rLj‐RGD3对HepG2细胞的增殖、凋亡、黏附、迁移、侵润的影响．结果显示：rLj‐RGD3能显著抑制HepG2细胞的增殖,IC50为3．8μmol／L ,诱导HepG2细胞发生凋亡,有效抑制 HepG2细胞黏附玻蛋白（VN）,抑制 HepG2细胞的迁移,且抑制率达58％,明显抑制以 bFGF 为趋化剂的 HepG2细胞穿透 Matrigel 的侵润行为．以上研究表明,rLj‐RGD3具有典型的RGD毒素蛋白抑制肿瘤细胞的功能,能够应用于抗肿瘤基因工程药物开发,具有重要的应用意义．     

福建大头蛙抗癌多肽FJ-2945抗肿瘤活性研究

探索本课题组自主发现的天然抗肿瘤多肽FJ-2945对肝癌细胞Hep3b增殖、迁移的影响并初步明确其作用机制.通过CCK8与RTCA实验检测FJ-2945对细胞增殖能力的影响;采用Transwell与划痕实验分析FJ-2945对于Hep3b迁移能力的影响;利用流式细胞分析法检测FJ-2945对Hep3b细胞周期的影响;最后通过qRT-PCR与免疫印迹实验检测FJ-2945对Hep3b细胞增殖、迁移相关因子在转录水平与蛋白水平的影响.与对照组相比,FJ-2945显著抑制Hep3b细胞的增殖与迁移能力,并促进Hep3b细胞凋亡.实验组中的Skp2蛋白含量显著降低,最终抑制Hep3b细胞增殖与迁移能力.由此说明多肽FJ-2945可以作为潜在的药物,通过靶向Skp2抑制肝癌细胞Hep3b增殖、迁移等过程,发挥抗肿瘤作用.     

蛋白激酶D1对骨髓间充质干细胞中CXCR4的调控作用

目的:探讨蛋白激酶D1(PKD1)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)存活、增殖、迁移和凋亡的影响,并分析PKD1对趋化因子受体4(CXCR4)表达的调控作用.方法:从Wistar大鼠股骨和胫骨中分离并收集BMSCs细胞,体外培养鉴定.实验分为5组:对照组(Control)、氧糖剥夺-复氧组(OGD)、PKD1组、AMD3100(CXCR4的特异性阻断剂)组和AMD3100-PKD1组.CCK-8法检测BMSCs的存活率,Tunel法检测BMSCs的凋亡情况,BrdU法检测BMSCs的增殖能力,Transwell法检测BMSCs的迁移能力,RT-PCR法检测BMSCs中CXCR4的mRNA表达,Western blot法检测CXCR4的蛋白表达.结果:PKD1预处理可明显提升BMSCs的存活、增殖和迁移能力(P0.05),减少BMSCs的凋亡数量(P0.05);并上调BMSCs中CXCR4 mRNA和蛋白的表达(P0.05).阻断剂AMD3100可降低PKD1预处理后BMSCs的存活、增殖和迁移能力,增加BMSCs的凋亡数量,下调BMSCs中CXCR4 mRNA和蛋白的表达,从而减弱PKD1对BMSCs的预处理作用.结论:PKD1可能通过调控CXCR4的表达发挥抗氧糖剥夺-复氧作用:减少BMSCs的凋亡,提高BMSCs的存活、增殖和迁移能力.     

日本七鳃鳗Lj-RGD3毒素肽的3种单RGD模体突变体的克隆表达及其抑制Lewis细胞活性研究

为了评价Lj-RGD3 3个不同位点RGD模体的存在是否对该蛋白功能具有必要性及影响程度,采用全序列合成的方法合成了3种基于Lj-RGD3的RGD缺失突变体基因,并成功对其进行了pET23b载体的构建及重组蛋白的表达和纯化.将这3种分别保留第1位、第2位、第3位RGD模体的重组蛋白各命名为rLj-113、rLj-114和rLj-115.比较了这3种重组蛋白对Lewis小鼠肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响,并对其是否能引起Lewis肺癌细胞凋亡进行了测定.结果显示,rLj-113、rLj-114和rLj-115对Lewis的增殖半抑制浓度IC_(50)值分别为2.73,2.75,2.53μmol/L,并且以剂量依赖的方式抑制Lewis小鼠肺癌细胞的增殖;突变体蛋白还能抑制以bFGF(basic fibroblast growth factor)为趋化剂的Lewis小鼠肺癌细胞的迁移及侵袭.综上可知,rLj-RGD3蛋白的RGD模体的位置并不影响其在抗Lewis小鼠肺癌细胞的生物活性,而保留单RGD模体的突变体rLj-113、rLj-114、rLj-115仍然具有抑制Lewis小鼠肺癌细胞增殖、迁移、侵袭以及诱导Lewis细胞凋亡的生物学活性.     

姜黄素与阿霉素联合应用抗肿瘤的协同作用

研究姜黄素与阿霉素联合应用对人纤维肉瘤HT1080、人乳腺癌MCF-7、人肺癌A549细胞的增殖抑制作用及诱导肿瘤细胞凋亡的协同作用,探讨其抗肿瘤协同作用的机制,为临床寻找有效的化疗增敏剂提供实验依据和理论基础.MTT法测定细胞增殖抑制率,结果表明5μmol/L姜黄素与阿霉素联合用药对HT1080、MCF-7、A549细胞均表现出协同抗肿瘤作用;Hoechst 33258荧光染色观察A549细胞凋亡的形态学变化;Westernblot法检测A549细胞bcl-2蛋白的表达,结果表明姜黄素与阿霉素联合应用可显著诱导A549细胞发生凋亡,其协同抗肿瘤的机制可能与下调抑凋亡蛋白bcl-2表达有关.