HIF-1调控小鼠bace1基因的转录表达

阿尔茨海默症的一个关键致病原因是大脑中淀粉样蛋白（A13）的过度产生或堆积．Aβ是由其前体蛋白APP经β-和γ-分泌酶依次水解而生成的，但对于这些分泌酶基因表达的转录调控的了解还很少．由于大脑发生缺氧／缺血会造成Aβ的产量增加，而缺氧时所激活的转录因子HIF-1（Hypoxia-Inducible Factor 1）会调控下游多种基因的表达，我们对HIF-1是否参与调控β-分泌酶的表达进行了研究．对小鼠β-分泌酶基因bace1的调控序列进行分析，发现其中含有一个缺氧应答元件（Hypoxia-Responsive Element，HRE）．我们的数据显示，HRE突变片段启动报告基因荧光素酶表达的活性比正常序列片段的启动活性明显降低．电泳迁移率的变动分析（EMSA）实验进一步证实，HIF-1可以与小鼠bace1中HRE元件相互作用．当在哺乳动物细胞中过度表达HIF-1时，BACE1的mRNA水平和蛋白质水平均有明显的增高．这些结果表明小鼠bace1基因的表达受转录因子HIF-1的调控．鉴于目前阿尔茨海默症研究领域都把抑制BACE1作为首选治疗靶位，HIF-1因而有可能成为治疗AD的一种药物靶点．     

中国鲎人工培育的幼体对不同环境适应性的研究

中国鲎由于具有很高的经济和药用价值,遭受大规模滥捕乱杀,鲎数量急剧锐减,目前我国鲎资源已面临枯竭的危险.人工育苗及海区放流是一种保护和恢复鲎资源种群有效可行的措施.我们从2004年7月至9月,在厦门水产技术推广站进行鲎人工授精,并以人工授精培育的鲎幼体为材料,模拟海区生态环境,自2004年10月14日至2005年3月15日进行鲎幼体钻沙、钻泥实验,并比较幼鲎在不同生态环境生长发育情况,共计152 d.结果表明,幼鲎具有钻入沙或泥的生活习性,且幼鲎在含沙或泥的海水比在普通海水中生长发育的情况更好.本实验结果为鲎苗海区人工增殖放流提供了实验依据.     

脑特异性高表达蛋白TMEM59L诱导细胞凋亡的机制

TMEM59L为近年来新发现的脑特异性高表达蛋白,具有促凋亡效果,但其具体的凋亡机制还不清楚.构建了TMEM59L重组质粒,并在HEK293T细胞中过表达TMEM59L,用Annexin V-FITC/PI双染法确定了TMEM59L可以诱导细胞凋亡,之后用免疫印迹方法检测细胞内凋亡相关分子激活情况.结果显示,外源TMEM59L可以降低Bcl-2的蛋白表达水平,诱导细胞色素c从线粒体释放进入细胞质,并且激活caspase-9、caspase-7和caspase-3,但不激活caspase-8;活化的caspase-7和caspase-3进一步酶解死亡底物PARP,导致细胞凋亡;此外,用广谱caspase抑制剂Z-Val-Ala-Asp-FMK(Z-VAD-FMK)抑制caspase-7和caspase-3活性后,死亡底物PARP的酶解也基本被抑制.由此可见,TMEM59L是通过caspase依赖的线粒体途径诱导HEK293T细胞凋亡.     

用酵母双杂交系统筛选与PEN-2蛋白胞内端相互作用的蛋白

γ-分泌酶复合体对β-淀粉蛋白前体蛋白(Beta-amyloid precursor protein,βAPP)的水解是生成β-淀粉蛋白(Aβ)的关键步骤,在阿尔茨海默氏症(Alzhei mer′s disease,AD)的病理发生中起着重要作用.PEN-2蛋白(Presenilin enhancerprotein 2)是γ-分泌酶的一个重要组分,在γ-分泌酶的组装和成熟中扮演重要的角色.此外,PEN-2还具有促进神经细胞存活和防止细胞凋亡的作用.为了进一步研究PEN-2的生理功能,以PEN-2为诱饵蛋白用酵母双杂交系统筛选与之有相互作用的蛋白,发现PCBP4和GRK5肽段可结合PEN-2,并在酵母体系用β-半乳糖苷酶报告基因验证了它们的相互作用.这些结果表明PCBP4和GRK5可能影响PEN-2的正常生理功能,并且有可能在阿尔茨海默氏症的形成中起着一定的作用.     

原癌基因K-Ras调控APPThr668位点磷酸化及APP的切割

在阿尔茨海默症(Alzheimer′s disease,AD)发病的早期,Ras蛋白所在的信号通路被激活,但具体作用机制还不清楚.探讨了K-Ras及其突变体K-RasG12V对淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的剪切的影响.Western blot结果显示,过量表达K-Ras能够激活细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase,ERK 1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路,并增加APP在Thr668的磷酸化;抑制JNK通路则阻断了K-Ras过表达所引起的APP Thr668磷酸化.此外,过表达K-Ras造成分泌到细胞外的sAPPα增加,而sAPPβ减少.通过生物素标记实验发现,过表达K-Ras使得APP在细胞膜上的定位增加,而细胞内APP总量没有改变.这些结果表明,过量表达K-Ras可以通过调控JNK的通路,增加APP在Thr668位点的磷酸化,造成APP在细胞膜上水平升高,导致APP向sAPPβ的切割减少,而向sAPPα的切割增加.提示K-Ras对APP切割的影响可能在AD的发病过程中起着一定的应激作用.     

Interaction of Stathmin-Like 2 Protein with the APP Intracellular Domain

Amyloid precursor protein （APP） plays a critical role in the formation of Alzheimer＇s disease （AD）. The intracellular domain APP （AID） was suggested to cause neurotoxicity in the nucleus. To investigate the functions AID, yeast two-hybrid screening was performed to identify the proteins which interact with AID. The human brain cDNA library was screened using pGBKT7-AID as a bait, and several positive clones were identified. One of them encodes a part of the human stathmin-like 2 protein （STMN2）. The interaction between STMN2 and APP implies that STMN2 may have an important function in APP-mediated AD formation.     

双杂交系统筛选与AID相互作用蛋白的初步研究

AID(APP intracellular domain)是由淀粉样前体蛋白APP经γ-分泌酶切割产生的胞内端，它可能参与细胞凋亡．基因转录等活动．并对阿尔茨海默氏症的形成有一定影响．为进一步研究AID的功能．在本实验中．我们用AID为诱饵蛋白．运用酵母双杂交系统筛选与其结合的蛋白，得到其中两个阳性克隆．一个为RPS21．另一个为FLJ20551．接着又在酵母体系用β-半乳糖苷酶报告基因验证了它们的相互作用．并在哺乳动物细胞中用免疫共沉淀的方法再次验证了它们相互作用的特异性．这些结果表明RPS21和FLJ20551可能通过与AID相互作用而影响阿尔茨海默氏症的形成。     

FAM105A通过caspase依赖性途径和Bcl-2家族诱导细胞凋亡

在多细胞有机体中,细胞凋亡对调节正常细胞活动和发育起着关键作用.对参与细胞凋亡的蛋白的鉴定及其机制的阐明具有重要意义.FAM 105 A是新发现的促凋亡基因,过表达会导致细胞凋亡.研究了FAM105A促进细胞凋亡的潜在机制,结果表明,在HEK293T细胞中过表达FAM105A会导致caspase-3和caspase-9的剪切/激活,同时伴随着多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP ribose polymerase,PARP)的切割/失活.此外,过表达FAM105A能诱导细胞色素c(Cyt c)从线粒体释放到胞质,促凋亡蛋白Bax的表达水平升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平下降.这些结果表明FAM105A诱导的细胞凋亡过程需要caspase依赖性途径和Bcl-2家族共同参与.     

SNX12调控BACE1的细胞内定位和Aβ的产生

不溶性β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)的沉积是阿尔茨海默症(Alzheimer′s disease,AD)的中心环节,Aβ是由β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶顺序切割β淀粉样蛋白前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)产生的,BACE1与APP在质膜、内含体/溶酶体、高尔基体反面膜囊(TGN)以及早期分泌途径之间的转运很大程度上影响了Aβ的产生.通过Western blot和免疫荧光的方法探讨了Sorting nexin12(SNX12)对Aβ产生的影响及其作用机制.Western blot结果显示过表达SNX12后,分泌到细胞外的Aβ减少,γ-分泌酶的活性及PS1、NCT、pen-2、APP和BACE1的蛋白水平没有明显变化,APP-βCTF水平降低,而下调SNX12时Aβ水平增加,与对照组相比,差异均具有统计学意义(p<0.05);免疫荧光结果表明,SNX12与BACE1在细胞内存在共定位,并且SNX12表达增加可以使BACE1和APP在细胞内处于同一区域的数量减少.这些结果表明,过表达SNX12通过调节BACE1在细胞内的定位,使细胞内处于同一区域的BACE1与APP的数量减少,导致经BACE1切割的APP减少,从而降低Aβ的产生.因此SNX12可能在AD的发病过程中起着一定的调节作用.