纳豆激酶基因重组表达载体的构建及其稳定性

利用PCR方法从分泌纳豆激酶的纳豆杆菌基因组DN中扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到表达载体PBV220上,筛选重组子,通过限制性内切酶和PCR技术分析,初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因,用凝块溶解时间法（CLT）测出表达产物具有溶解血栓活性,证明该基因可在大肠杆菌中表达,对重组菌中重组质粒的稳定性进行研究,结果表明质粒的插入对宿主菌的生长没有太大影响,该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性,但结构稳定性较差,SDS-PAGE分析结果表明基因产物为分泌型,蛋白表达量占菌体蛋白的12%左右。     

两种消除Klebsiella pneumoniae重组型质粒的方法

对于工业发酵菌种肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),研究发现有两种消除其重组型质粒的有效方法,一种是连续传代培养,另一种是使用消除剂十二烷基硫酸钠(SDS)。对K.pneumoniae重组菌连续20代传代培养后,发现其质粒具有较高的消除率;而以0.2%SDS复合Ca2+处理K.pneumoniae重组菌,也能有效消除其重组型质粒,且该方法省却了反复的传代培养,能快速得到质粒消除菌,更具简便易操作性。消除了质粒的K.pneumoniae能再次接纳新的质粒,有效避免了因质粒不相容性带来的转化不成功,进而可用作宿主菌积累更多的生理性状。     

瑞替普酶在乳酸乳球菌中的表达

为建立溶栓药物瑞替普酶(r PA)的乳酸菌表达系统,从实验室前期构建的大肠杆菌表达质粒p ET22b-rpa上扩增出目的基因rpa,将该基因与乳酸菌表达质粒pCYT连接,构建了pCYT-rpa质粒.此外,为提高r PA在乳酸乳球菌NZ9000中的稳定性,同时构建了rpa位于葡萄球菌(Staphylococcal)耐热核酸酶基因nuc下游融合表达的重组质粒pCYT-nuc-rpa.将质粒p CYT-rpa和p CYT-nuc-rpa分别电转化至乳酸乳球菌NZ9000中,经Nisin诱导表达,Western blot结果显示Nuc可提高r PA在乳酸乳球菌中的稳定性,从而增加了rPA在乳酸菌中的表达量.重组r PA及Nuc-rPA在复性后均具有溶栓活性,活性分别为800,U/L和1,000,U/L.     

重组人尿激酶原基因的克隆及工程菌的构建与鉴定

利用RT－PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆重组人尿激酶原基因,用表达质粒pET29a构建了重组质粒pET29a/prouk,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,作为工程菌。经IPTG诱导表达,在46kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20％。该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性。     

葡萄球菌新型肠毒素rSEP的原核表达与纯化研究

通过对扩增的金黄色葡萄球菌sep基因序列进行载体构建和双酶切鉴定,将酶切验证的pET-30a-SEP重组质粒分别转入不同的大肠杆菌表达宿主中,选择出最佳表达宿主菌,并进一步优化表达条件,实现重组融合蛋白(rSEP)的可溶性表达;采用Ni~(2+)亲和层析最终获得纯化的rSEP蛋白.研究结果为后续制备单抗、诊断试剂及肠毒素SEP蛋白的致病机制研究奠定基础.     

嗜根考克氏菌翻译延伸因子P基因的克隆、表达及其条件优化

为获得大量可溶性重组蛋白EF-P用以构建以EF-P蛋白为靶标的新型、高效抗细菌抗生素筛选模型,研究嗜根考克氏菌DC2201 efp基因的体外克隆、表达及表达条件的优化.首先对efp基因进行生物信息学分析,随后经PCR特异性扩增获得efp基因并将其插入表达质粒pET-29a(+)中,重组质粒(pET-29a(+)-efp)转化至表达宿主菌株E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,通过优化诱导表达条件(起始菌体浓度、温度、IPTG终浓度、时间)获得大量可溶性目的蛋白,最后对表达产物进行镍离子亲和层析柱纯化及SDS-PAGE、MALDI-TOF-TOF鉴定.结果获得相对分子质量大小约为25 kDa的蛋白条带,与预测的目的重组蛋白相对分子量大小相符.选择O_(D600 nm)     

叶绿体CrFtsZ2蛋白对E.coli形态的影响

FtsZ蛋白在细菌的分裂中担任着重要作用,能够在分裂位点形成一个环状结构而控制细菌的分裂过程。胞内FtsZ蛋白浓度的异常升高或降低均可阻断正常的细胞分裂过程进而形成分裂异常的丝状菌体。我们为了进一步研究衣藻FtsZ蛋白的生物学活性,建立了CrFtsZ2-EGFP融合蛋白原核表达的对照体系。结果表明：低浓度IPTG促进转化有表达质粒pLGZ2的大肠杆菌JM109伸长,高浓度IPTG则抑制其伸长;融合表达质粒的过量表达导致宿主菌形成了丝状菌体,不但菌体长度随浓度梯度而有规律性的变化,而且CrFtsZ2-EGFP融合蛋白沿着宿主菌体的纵轴方向有规律地聚集成荧光点或荧光带。更进一步验证了衣藻CrFtsZ2蛋白的功能。     

牦牛病毒性腹泻病毒P20和P14蛋白基因的原核表达及其产物检测

以牦牛BVDV基因组DNA为模板, 运用聚合酶链反应首次成功扩增出牦牛BVDV P20及P14基因, 并将其插入到pET-28a原核表达载体, 构建重组表达质粒pET-28a-P20和pET-28a-P14并分别转化至Rosetta(DE3)和BL21(DE3) 宿主菌中, IPTG诱导表达, 经SDS-PAGE检测, pET-28a-P20在宿主菌Rosetta(DE3)和BL21(DE3)中表达出约26KU的融合蛋白, pET-28a-P14表达出约20KU的融合蛋白, 结果分析表明p20和p14蛋白在两个宿主中都获得了高效表达, 表达出的蛋白大小与预期结果相符.     

rhB工程菌在不同浓度氨苄青霉素选择压力下平板和摇瓶100代稳定性考察

rhB工程菌平板和摇瓶在不同浓度氨苄青霉素选择压力下 ,培养传代 10 0代 ,经各项检测表明 :rhB表达水平、质粒性状及其遗传稳定性和染色特性、菌体形态等理化特性均与原代菌无差异 ,且无支原体及其他微生物污染 ,可作为生产用菌株 .     

质粒pGEX-4T-2在表达宿主菌中的分离稳定性

为了寻找影响质粒pGEX-4T-2在表达宿主菌中分离稳定性有关的因素及水平,将质粒pGEX-4T-2转化到表达宿主菌JM109中.挑取单克隆后培养过夜,10%量接种培养,5h后将菌液稀释106倍后等量的分别涂布到LB和LA固体培养基中,37℃培养过夜后数其菌落数,二者相比得到分离稳定率.数据分析采用F-检验,多重比较采用LSR法及Q法.经统计学处理,抗生素的浓度,培养温度以及它们的交互作用对质粒pGEX-4T-2在表达宿主JM109中的分离稳定性均有显著性的影响,并且随着抗生素的浓度的提高质粒pGEX-4T-2在表达宿主JM109中的分离稳定性有提高的趋势.     

共表达KnobS蛋白与LTB蛋白的重组干酪乳杆菌构建

在干酪乳杆菌中表达减蛋综合征病毒纤维蛋白KnobS,并分析其抗原性。分别将编码减蛋综合征病毒主要免疫保护性抗原纤维蛋白KnobS与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因插入干酪乳酸杆菌分泌表达载体pMG36e-UP/L中,成功构建重组表达载体pMG36e-UP/LTB-KnobS,获得表达融合蛋白KnobS-LTB的重组乳酸菌干酪乳杆菌表达系统;经SDS-PAGE和Western-blot检测表明,有大小约41kD的蛋白表达,具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性。在干酪乳杆菌中成功地表达了含减蛋综合征病毒抗原的融合蛋白KnobS-LTB,且具有较好的抗原性,为减蛋综合征病毒重组乳酸菌活菌口服疫苗的研制奠定重要的物质基础。     

Paenibacillus sp. K1 乳糖酶基因bga在乳酸乳球菌中的表达

为了提高乳酸乳球菌利用乳糖的能力,缓解乳糖不耐症,以实验室构建的含有乳糖酶基因的质粒pUC-bga为模板,通过PCR扩增得到乳糖酶基因bga,将其分别与载体pSEC和pMG36e连接,获得重组质粒pSEC-bga和pMG36e-bga,重组质粒分别电转Lactococcus lactis NZ9000和Lactococcus lactis MG1614,并在乳酸乳球菌细胞内实现了活性表达。高压液相色谱（HPLC）分析其对培养基中乳糖的利用能力,结果重组菌L.lactis NZ9000-Bga对乳糖的利用能力比对照菌株高一倍,为生产低乳糖的发酵乳制品奠定了基础。     

黑曲霉F246的phyA基因克隆及其新型表达载体构建

利用PCR法直接从自行筛选、鉴定的黑曲霉F246中扩增出phyA基因,再将PCR产物重组于乳酸菌表达载体pMG36e,构建phyA基因的新型表达载体pMG36e-phyA.以黑曲霉F246基因组为模板,对phyA基因的成熟肽(1 347 bp)进行PCR扩增.再将PCR产物克隆入pMD18T质粒,经DNA测序和氨基酸分析、鉴定正确后,亚克隆入乳酸菌表达质粒pMG36e,构建工程菌Lactobacillus MG1363-pMG36e-phyA.重组乳酸菌表达载体pMG36e-phyA的构建,可望获得大量、高活性植酸酶,为研制多功能微生态制剂奠定基础.     

农杆菌介导的怀山药叶片瞬时表达方法的建立

高效的瞬时表达体系是方便、快捷的研究怀山药基因启动子活性、基因功能和生产重组蛋白的新途径.本研究选取怀山药叶片为受体,以β-葡糖醛酸酶(GUS)和绿色荧光蛋白(GFP)的基因为报告基因,对共培养时间进行分析,得到二者瞬时表达的最初时间以及较佳观察时间,建立根癌农杆菌介导的怀山药瞬时表达技术体系.结果显示:当注射的菌液浓度OD600=0.6,共培养3d时,GUS基因和GFP基因开始有表达,二者适于观察的共培养时间分别为5d和4d.     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在干酪乳杆菌中的分泌表达

以大肠杆菌和乳酸菌穿梭表达型载体pMG36e为基本模型,采用重叠延伸PCR方法拼接相关调控元件构建一种乳酸杆菌组成型分泌表达载体;将编码LTB蛋白的eltb基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体中,构建重组质粒pMG36e-UP/L-LTB,电转化于干酪乳杆菌393中,筛选获得重组干酪乳杆菌,应用westernblot方法鉴定LTB表达情况.Western-blot分析显示,约有12 KDa的目的蛋白以分泌形式表达,可被LTB阳性血清识别.表明LTB蛋白在重组干酪孔杆菌获得了表达,并且具有免疫反应活性和佐剂活性,为以LTB为分子佐剂研制乳酸菌黏膜疫苗奠定基础.     

越南伯克霍尔德氏菌B418的红色荧光蛋白标记及功能稳定性

利用氨基纳米黏土介导的转化方法，应用红色荧光蛋白DsRed标记生防细菌越南伯克霍尔德氏菌Burkholderia vietnamiensis B418并研究标记菌株的功能稳定性。将带有DsRed基因的重组质粒pGEX-4T-1-DsRed转化导入B418菌株中，采用细菌培养法、继代培养法和平板对峙培养法检测标记菌株的功能稳定性。通过氨基纳米黏土转化体系成功获得了荧光标记菌株B418-DsRed,与野生菌株B418相比，其生长曲线和形态学特征基本一致。继代培养10代后，标记菌株在共聚焦显微镜下呈现亮红色荧光，能够提取到外源质粒pGEX-4T-1-DsRed,并通过聚合酶链式反应扩增获得荧光基因序列DsRed,证明标记菌株具有较好的遗传稳定性。平板对峙培养试验显示，标记菌株B418-DsRed对尖孢镰孢菌和大丽轮枝菌抑制率分别为55.25%和67.55%,与野生菌株B418无显著性差异，表明外源质粒的导入未影响菌株的抑菌能力。以上结果表明通过氨基纳米黏土介导成功实现了伯克霍尔德氏菌B418的红色荧光蛋白标记，构建的标记菌株B418-DsRed可用于该生防菌在植物根际的定殖及与病原菌的互作研...     

Expression of green fluorescent protein gene with baculovirus vector in insect cells

The green fluorescence of bioluminescent jellyfishAequorea victoria is due to the presence of the green fluorescent protein (GFP). To examine whether the GFP gene can be applied as a reporter gene in insect cells, a baculovirus transfer vector containing the neomycin resistance gene (neo) was established. The GFP gene was subcloned into the vector downstream of the polyhedrin gene (ocu) promoter. In the presence of G418, the recombinant virus can be purified. Expression of the GFP gene in the recombinant virus should give rise to synthesis of the GFP with a molecular weight of 30×10³ dalton, and is observable by the strong green light irradiated by ultraviolet or blue light in viable intact insect cells. The GFP produced in insect cells has typical fluorescent spectra indistinguishable from those of the purified native GFP. The GFP gene as a good reporter gene can be applied to the baculovirus-insect cell expression system. Supported by the National Natural Science Foundation of China Hu Jianhong: born in July, 1972, Master graduate student     

带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物重组表达质粒pBI-GFP的构建

利用 DNA重组技术 ,将经定点突变改造的绿色荧光蛋白基因 ( gfp)克隆到植物表达载体p BI-1 2 1中 ,成功地构建了植物重组表达质粒 p BI-GFP.     

菠菜叶绿体基因组定点整合表达载体构建及原核表达

分析菠菜叶绿体基因组全序列,选用了rbcL基因和accD基因的间隔区作为外源基因的定点整合位点,并从菠菜叶绿体基因组中克隆了rbcL基因全长和accD基因的5′端部分,长度分别为1956 bp和1320 bp。以这2个DNA片段作为同源重组片段,以烟草叶绿体基因的启动子Prrn和终止子psbA3′控制外源基因的转录,构建了包含筛选标记基因aadA基因(编码氨基糖苷-3′-腺苷酸转移酶,具有壮观霉素和链霉素抗性)和报告基因GFP(编码绿色荧光蛋白)的菠菜叶绿体基因组定点整合表达载体pRAGA。酶切结果显示构建正确。将该载体转化大肠杆菌,在激光扫描共聚焦显微镜下用488 nm蓝光激发,发现大肠杆菌发出强烈的绿色荧光,而对照菌体没有荧光,表明GFP基因在原核大肠杆菌中已经成功表达。实验结果说明构建的菠菜叶绿体定点整合表达载体pRAGA可以用于菠菜叶绿体转化。     

根癌农杆菌介导的GFP在洋葱表皮细胞定位研究

采用根癌农杆菌介导的方法,以受控于CaMV35S启动子的携带有GFP报告基因的双元植物表达载体pCAMBIA1300-35S-GFP转化洋葱表皮细胞.荧光显微镜下观察结果显示,GFP基因在经浸染和共培养后的洋葱表皮细胞中得到了表达,绿色荧光分布在细胞核和细胞质中,为进一步研究新基因的亚细胞定位和瞬时表达奠定了基础.