紫花苜蓿转录因子MsDREB1基因表达产物的亚细胞定位

利用生物信息学方法对紫花苜蓿MsDREBl进行了生物信息学分析．结果表明,该序列舍有AP2典型结构域,在N端存在核定位信号．为进一步验证该基因功能,构建MsDREBl与绿色荧光蛋白（GreenFluorescentProtein,GFP）基因融合的植物表达载体pCAMBIAl302-MsDREBl,再利用基因枪将其转入洋葱表皮细胞,在共聚焦扫描显微镜下观察MsDREBl基因表达产物在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位．结果表明,MsDREBl基因表达产物定位于细胞核中,符合DREB家族转录因子特性．     

一个与ABA信号通路相关未知基因AB的亚细胞定位研究

本研究通过构建一个与脱落酸（ABA）信号传导途径相关的未知基因AB和绿色荧光蛋白（GFP）编码基因的重组质粒,利用基因枪技术将该重组质粒成功转入洋葱表皮细胞,观察并确定了该基因编码蛋白细胞核和细胞质的亚细胞定位,为进一步研究该未知基因的生物学功能及其分子机制提供了思路.     

拟南芥翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位研究

探讨了拟南芥的翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位.以Col野生型拟南芥的cDNA为模板,通过高保真KOD扩增酶获得2 363bp的拟南芥转录延伸因子EF1A基因片段,将其与GFP融合后共同连入p1300表达载体,利用农杆菌侵染法将p35S∶GFP和p35S∶EF1A∶∶GFP转入野生型拟南芥中,观察转基因植物细胞中GFP的表达情况.结果显示:p35S∶GFP转基因植物中,细胞核中GFP荧光强度显著高于细胞质中荧光强度,但是在p35S∶EF1A∶∶GFP转基因植物中,细胞核中荧光强度与细胞质中荧光强度无显著差异,说明在进行蛋白翻译时细胞质中的EF1A含量显著高于细胞核中,这也为翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位提供了实验依据.     

马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位

为了研究马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位情况,采用RT-PCR技术克隆到马铃薯StHb1基因cDNA序列,并成功构建了StHb1基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pBI121-StHb1-GFP.利用农杆菌介导法将重组载体转化洋葱内表皮细胞,通过荧光显微镜观察融合蛋白的瞬时表达以确定StHb1蛋白在细胞内的分布.结果表明StHb1蛋白主要分布于细胞核中.     

基于壳聚糖纳米颗粒的基因枪法转化洋葱细胞研究

以交联法制备壳聚糖纳米颗粒,用透射电子显微镜和Zeta电位仪对壳聚糖纳米颗粒进行表征,发现颗粒呈球形,粒径约为50rim,微球表面光滑、球形团整、颗粒比较均匀、分散性好,电位约为11．1mv;琼脂糖凝胶电泳结果显示,壳聚糖纳米颗粒能有效地结合质粒DNA,并能保护所结合的DNA防止DNaseⅠ的酶切;将含GFP基因的壳聚糖纳米颗粒复合物使用基因枪转化洋葱表皮细胞,在倒置荧光显微镜下观察,发现细胞表达了绿色荧光蛋白,表达效率为8％．     

几种诱导昆虫细胞RNA干扰质粒的构建和效果比较

构建了四种可以在昆虫细胞中表达形成dsRNA的质粒,比较了其诱导RNA干扰,抑制目标基因———绿色荧光蛋白(GFP)基因表达的效果.四种质粒都不同程度地抑制了质粒介导的GFP表达,其中尤以单个果蝇hsp70启动子表达反向重复序列,并带有杆状病毒AcMNPV增强子hr5的质粒效果最佳,使GFP表达量下降到原来的3.9%.当用于抑制由杆状病毒介导的GFP表达时,以两个相向排列的AcMNPV ie1基因启动子的构造有明显的抑制效果.这些结果对于在昆虫细胞中有效地利用RNA i研究基因功能有参考意义.     

水稻中两个同源异型结构域转录因子的亚细胞定位

为了对水稻同源异型结构域转录因子HD-ZipⅢ家族中的HDZ1和HDZ2进行亚细胞定位,利用RT-PCR技术从水稻cDNA中扩增HDZ1和HDZ2的编码区(去除终止密码子序列),与绿色荧光蛋白GFP编码框融合,构建2个转录因子的瞬时表达载体,采用农杆菌介导的转化方法转化至烟草中进行瞬时表达分析.结果表明:PCR扩增所得为目的基因片段HDZ1和HDZ2;二者与载体质粒pCAMBIA35S-GFP连接获得的融合表达载体成功移至烟草中并表达;确定HDZ1主要定位于烟草叶片的气孔中,而HDZ2定位于烟草表皮细胞的细胞膜上.二者在亚细胞中的定位不同,可能在水稻生长发育中所起的作用也不相同.     

马铃薯Y病毒辅助成分蛋白酶与加工番茄OPA3-like蛋白结合及其定位研究

为了研究加工番茄OPA3-like蛋白与马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的辅助成分蛋白酶(helper component proteinase,HC-Pro)的相互作用,进行了2种蛋白的结合及其定位研究。通过PCR的方法从加工番茄中克隆OPA3-like基因,同时利用Blast方法对其分析,进行了OPA3-like蛋白基因氨基酸序列同源性分析。通过构建双分子荧光互补载体pSPYCE-35S-OPA3-like和pSPYNE-35S-HC-Pro,利用农杆菌介导法共侵染洋葱表皮细胞60 h后,在共聚焦显微镜下观察洋葱表皮细胞中的黄色荧光。结果显示:加工番茄OPA3-like基因ORF长510 bp,编码169个氨基酸,编码蛋白属OPA3蛋白家族。激光共聚焦显微镜下可观察到沿细胞膜呈小泡状分布黄色荧光,说明PVY的HC-Pro蛋白与加工番茄OPA3-like蛋白结合并且共定位在细胞膜附近。这为进一步研究PVY的HC-Pro蛋白与加工番茄OPA3-like蛋白的相互作用机制奠定了一定的基础。     

拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白的亚细胞定位

为确定拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan-protein,AGP)的亚细胞定位,克隆了这个基因的编码区,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建融合表达载体,经农杆菌介导转化烟草BY-2悬浮细胞.利用激光扫描共聚焦显微镜,在稳定转化的BY-2细胞表面观察到绿色荧光.研究结果表明,此AGP分布在细胞膜表面.     

E-cadherin 启动子的荧光示踪体系的建立及验证

为实现对肺癌 A549 细胞的EMT 示踪,构建了 E-cadherin 基因启动子的慢病毒质粒,并与包装质粒pVSVG、Δ8.91 共转染 HEK293T 细胞,包装成有活性的慢病毒,收取病毒感染 A549 细胞,利用流式细胞仪和 Western blot 检测感染成功. 进一步用 TGF-β 诱导感染成功的 A549 细胞,通过在荧光显微镜下观察荧光变化、荧光定量 PCR 和 Western blot 检测GFP 和E-cadherin 的变化,发现在 TGF-β 诱导 48 h 后,A549 细胞形态由鹅卵石样变成长梭形. 并且荧光显微镜观察到相比较于未诱导的细胞,诱导后的A549 细胞绿色荧光明显变暗,同时 GFP 和 E-cadherin 的 RNA 水平和蛋白质表达水平均降低. 以 E-cadherin 基因启动子为基础建立了A549 细胞的EMT 荧光示踪体系,为进一步研究肺癌的 EMT 过程提供了材料.     

Expression of green fluorescent protein gene with baculovirus vector in insect cells

The green fluorescence of bioluminescent jellyfishAequorea victoria is due to the presence of the green fluorescent protein (GFP). To examine whether the GFP gene can be applied as a reporter gene in insect cells, a baculovirus transfer vector containing the neomycin resistance gene (neo) was established. The GFP gene was subcloned into the vector downstream of the polyhedrin gene (ocu) promoter. In the presence of G418, the recombinant virus can be purified. Expression of the GFP gene in the recombinant virus should give rise to synthesis of the GFP with a molecular weight of 30×10³ dalton, and is observable by the strong green light irradiated by ultraviolet or blue light in viable intact insect cells. The GFP produced in insect cells has typical fluorescent spectra indistinguishable from those of the purified native GFP. The GFP gene as a good reporter gene can be applied to the baculovirus-insect cell expression system. Supported by the National Natural Science Foundation of China Hu Jianhong: born in July, 1972, Master graduate student     

Introduction of exogenous DNA into cotton via the pollen-tube pathway with GFP as a reporter

The green fluorescent protein (GFP) gene from the jellyfishAequorea victoria as a vital reporter for gene expression in plants is considered to have several advantages over other reporter genes. The pBIN35S-mGFP4 plasmid DNA has been introduced into cotton embryos by the pollen-tube pathway method. A transformed seedling has been verified according to its GFP-related fluorescence and Southern blotting analysis. The results provided direct and convincing facts in cytology and molecular biology for the pollen-tube pathway method, an efficient transformation technique used in plants.     

Analysis of the Cotton E6 Promoter

An E6 gene from sea island cotton （Gossypium barbadense） was expressed specifically in cotton fiber cells to transfer functions to cultivated species for better transgenic engineering. The regulatory activity of the E6 promoter region was then studied by isolating a 614-bp fragment of the 5＇-flanking region from upland cotton （Gossypium hirsutum CR1-12） to produce a green fluorescent protein （GFP） reporter construct for analysis of tissue-specific expression in transgenic tobacco seedlings. Fluorescent analyses indicate that the relatively short E6 promoter is sufficient to direct green fluorescent protein expression specifically in the leaf trichomes （hair cells） of the transgenic tobacco plants. As cotton fibers are also unicellular trichomes that differentiate from epidermal cells of developing cotton ovules, the result suggests that the relatively short E6 promoter can serve as a fiber-specific expression promoter for genetic engineering to improve cotton fiber quality.     

线粒体定位序列介导的绿色荧光蛋白基因在烟草中表达的分析

由于绿色荧光蛋白可在活组织或细胞中直接检出 ,因而近年已在转基因植物的研究中用作报告基因 ,这样可在植物生长的任何阶段进行活体筛选和鉴定。本研究利用线粒体定位序列对改良 gfp基因在转基因烟草中的表达进行了观察 ,结果表明 :将GFP直接在细胞质中大量表达会对植物细胞产生毒性 ,从而影响植物细胞的分化 ,而将其定位在线粒体中 ,则从转化细胞产生植株的频率明显增高。     

拟南芥ACOS5基因表达模式分析

探讨了拟南芥ACOS5基因的表达模式.采用PCR方法对拟南芥col生态型基因组进行扩增,获得ACOS5基因启动子序列,将其连入p1300植物表达载体中以GFP作为报告基因,并将该载体通过农杆菌转基因转入拟南芥col生态型中,观察转基因植物花药中GFP的表达情况.结果:ACOS5::GFP转基因植物从花药发育第四期到十二期均有GFP表达,GFP的表达峰值在第八期.结论:该表达载体可用,且ACOS5基因从花药发育第四期开始有微弱表达,且随着时期发展逐渐增强,至第八期达到表达最高峰值,随后随时期发展表达量逐渐减弱.     

Npas4基因过表达慢病毒的构建及其在SK-N-SH细胞的表达

研究旨在构建Npas4基因过表达慢病毒,为进一步深入探索Npas4基因的功能奠定基础。用人工合成大鼠Npas4基因c DNA片段,将其插入p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP构建慢病毒表达质粒p CDH-Npas4。酶切、测序验证质粒后,将p CDHNpas4和辅助质粒共转染包装细胞293T,浓缩上清得病毒颗粒并测定病毒滴度。取病毒颗粒感染SK-N-SH细胞48 h,收集细胞采用Western blotting法检测Npas4蛋白的表达。p CDH-Npas4携载正确Npas4基因,将其包装293T细胞后能产生病毒。病毒滴度为1.05×109TU/m L。相比于转染GFP病毒对照组(GFP)和未转染对照组(control),Npas4重组慢病毒组(Npas4)的细胞Npas4蛋白表达显著增高。成功构建Npas4基因过表达的重组慢病毒载体p CDH-Npas4,并获得高效的重组慢病毒,能将外源Npas4基因导入SK-N-SH细胞,为进一步研究Npas4基因的相关功能奠定了基础。