OFFGEL和LC-MS联用分析SH-SY5Y 细胞分泌蛋白质组

建立了游离胶分馏器(OFFGEL)和反相液相色谱质谱(LC-MS)联用分析SH-SY5Y细胞分泌蛋白质组的新方法.收集SH-SY5Y胞外蛋白用胰酶酶切成肽段后,用OFFGEL进行预分离并用LC-MS进行检测.用Mascot检索出88个蛋白,再通过生物信息学软件SignalP对Mascot检索的蛋白进行预测和筛选,共得到31种蛋白,用SingalP中的神经网络法和隐马可夫模型对其中的CERU_HUMAN进行分析,发现该蛋白是分泌蛋白,且信号肽的剪切位点在第19和第20氨基酸之间,软件SingalP提升了鉴定分泌蛋白的可靠性.     

南方水牛奶酪蛋白及大豆蛋白肽指纹图谱的差异性

通过LTQ Orbitrap XL组合型傅里叶变换高分辨质谱与反相高效液相色谱技术联用建立了南方水牛奶酪蛋白和大豆蛋白主要组分肽质指纹图谱,并对其氨基酸组成与序列进行了比较.结果表明:酪蛋白经胰蛋白酶酶解后得到的28个肽段中没有检测到与酶解大豆分离蛋白181个肽段相匹配的肽段;酪蛋白(CN)的主要组分是αs1-CN、β-CN、κ-CN,大豆蛋白的主要组分为大豆球蛋白(包括大豆球蛋白G1~G5亚基)和β伴大豆球蛋白(α,α',β链);水牛奶酪蛋白和大豆蛋白在亚基组分的氨基酸数量、组成比例和排列方式均呈现出明显的差异,大豆蛋白的各组分亚基的氨基酸全序列均大于酪蛋白各组分的氨基酸全序列,且大豆蛋白各组分的分子质量均显著高于酪蛋白各组分.LTQ Orbitrap XL质谱技术对乳源蛋白肽质指纹的分析,为今后鉴定分析牛奶蛋白中是否添加廉价蛋白提供了高精度和高准确度的检测方法,也为复杂混合物中的痕量组分检测提供了理论依据.     

两种胰蛋白酶酶解羊肌肉总蛋白样品的质谱分析

摘要: 目的比较国产和进口两种胰蛋白酶对蛋白质的酶解效果,为后续蛋白质组学稳定研究提供依据。方法用超声破碎法提取羊肌肉组织总蛋白,经两种胰蛋白酶酶解后液相色谱串联质谱检测酶解肽段,将结果上传蛋白质序列数据库,利用质谱分析鉴定方法分析比较两种胰蛋白酶的酶解效果,并借助生物信息学工具对所得数据进行分析。结果两种胰蛋白酶酶解同种蛋白质样品产生的肽段长度86%以上均为6-18 个氨基酸,适用于质谱检测。酶解后肽段产生的质量国产胰蛋白酶优于进口胰蛋白酶,国产胰蛋白酶比进口胰酶酶解可多鉴定到19% 的蛋白质和34%的肽段。结论进口、国产的胰蛋白酶在酶解蛋白质方面均可用于质谱检测前蛋白质的酶解消化。但国产胰蛋白酶价格明显低于进口胰酶,更具应用优势。本研究为评价胰蛋白酶酶解效果提供了一种有效、全面的研究方法。     

重组毕赤酵母植酸酶N-糖基化位点质谱鉴定

为系统评估重组毕赤酵母植酸酶的N-糖基化充分性,建立了一种通过联用高效液相色谱-串级质谱来分析植酸酶氨基酸序列及N-糖基化位点的技术.分别发酵了3株基因组已整合不同植酸酶基因的毕赤酵母.发酵液上清经离子交换与凝胶过滤后获得纯化的植酸酶.使用PNGase F或Endo H脱糖基化酶处理植酸酶后,用胰蛋白酶消化脱糖基化产物.通过纳升级高效液相色谱分离胰蛋白酶切产生的肽段混合物.并在联用的串级质谱上进行肽段测序与N-糖基化位点鉴定.结果显示3种植酸酶蛋白的可检测序列覆盖率均在69%以上,且与文献报道不同,均存在糖基化位点修饰不充分的现象.本实验结果证明了高效液相色谱-串级质谱联用法检测植酸酶N-糖基化位点的有效性,并为植酸酶的糖基化研究提供了新的基础.     

禁食对小鼠下丘脑磷酸化蛋白质组的影响

本研究旨在通过干预小鼠进食,探讨对小鼠下丘脑中蛋白质磷酸化修饰和相关信号通路的影响,为完善蛋白磷酸化调控网络提供有价值的信息.将实验小鼠平均分为3组,分别为对照组(con)、禁食组(D2)和禁食后恢复组(DR),每组小鼠数量为3只.在48 h内,con组正常提供饲料,D2组不提供饲料,DR组前44 h不提供饲料、后4 h提供饲料.同时解剖3组小鼠并提取下丘脑组织,提取、纯化和酶解下丘脑组织的蛋白质,并采用二氧化钛富集分离技术富集磷酸化肽段,运用高通量液相色谱-质谱联用进行检测,以鉴定样品中的磷酸化蛋白质组.利用非标记定量方法筛选差异表达的磷酸化蛋白以及位点,对鉴定数据进行GO富集和KEGG通路分析,并探究磷酸化蛋白间的相互作用关系.结果显示,共鉴定到4 810个磷酸化蛋白质,对应于14 259个磷酸化位点发生了变化.采用数学统计方法分析,成功确认小鼠下丘脑中有681个磷酸化蛋白差异显著,观察到这些差异蛋白与蛋白结合、激酶行为、转运、轴突生成等分子活动和生物学过程有关,并富集到了MAPK、细胞内噬和环磷酸腺苷信号通路等11个主要的信号通路.这说明禁食会对小鼠下丘脑中多种蛋白质的磷酸化修饰...     

天然抗冻多肽的制备、 分离及细菌低温保护活性研究

利用热水抽提法提取鲨鱼皮明胶,控制酶法水解条件制备天然抗冻多肽.以细菌低温保护活性为指标,筛选蛋白水解酶种类及酶解时间,利用Sephadex G-50凝胶过滤色谱、SP-Sephadex C-25强阳离子交换色谱等分离手段进行分离,得到细菌低温保护高活性组分.结果表明,酶解鲨鱼皮明胶得到高活性抗冻多肽的最适蛋白水解酶为酸性蛋白酶,酶解温度50℃、pH 3.0、酶/底物3 000 U·g-1、底物浓度3%、酶解时间1 h;经过Sephadex G-50凝胶过滤色谱、SP-Sephadex C-25强阳离子交换色谱等分离手段得到阳离子的P2组分,经过细菌低温保护测试,当浓度为500μg·mL-1时,大肠杆菌的存活率达到80.8%.分离得到的抗冻多肽具有较高的抗冻活性,可望应用于食品、医药等产业中.     

铜绿假单胞菌SJTD-1的磷酸化蛋白质组学

制备了铜绿假单胞菌SJTD-1菌株的蛋白质组酶解产物,并利用二氧化钛磁珠从酶解产物中富集磷酸化肽.首次利用纳升液相色谱-质谱技术鉴定磷酸化肽的磷酸化位点,最终共鉴定获得13条磷酸化肽,分别来自12个磷酸化蛋白,其中有7个磷酸化蛋白在假单胞菌中是首次发现.分析鉴定到的磷酸化蛋白,发现大多与DNA复制、物质转运、能量代谢等密切相关.这是首次对铜绿假单胞菌SJTD-1菌株进行磷酸化蛋白质组学分析,为SJTD-1在DNA复制、物质和能量代谢以及细胞膜转运等方面的研究奠定基础.     

两种用于液质联用分析的蛋白质酶解处理效果比较

【目的】分析和评估两种蛋白质溶液酶解方法,为蛋白质组学研究中的大规模质谱鉴定分析建立一种稳定的样品制备技术。【方法】分别使用TEAB法(实验组A)和TFE法(实验组B)对牛血清白蛋白(BSA)进行还原、烷基化和溶液酶解,再用LTQ-Orbitrap高分辨率质谱仪采集BSA酶切肽段信息,比较两种方法得到的数据信息,分析肽段数目、可变修饰位点和蛋白质覆盖率。【结果】实验组A(TEAB法)获得36个肽段、39个修饰位点,蛋白质平均覆盖率为59.31%;实验组B(TFE法)获得27个肽段、27个修饰位点,蛋白质平均覆盖率为47.83%,实验组A的数据指标与实验组B差异显著。【结论】采用TEAB法酶切体系能实现蛋白质高效率酶切,达到获得较高肽段覆盖率的目的,可为蛋白质组学后期的质谱分析鉴定奠定实验基础。     

基于蛋白质组学技术筛查维吾尔族妇女宫颈癌前病变患者血浆蛋白预警标志物

 依托蛋白质二维液相色谱和质谱技术,寻找与新疆维吾尔族妇女宫颈癌癌前病变高度宫颈鳞状上皮内瘤样变(HSIL)相关的血浆预警蛋白标志物,旨在对宫颈癌做到早期预防和诊断。收集维吾尔族HSIL(21例)和宫颈炎(22例)患者血浆标本并制备血浆低丰度蛋白质组样品,通过对蛋白质二维液相色谱系统的分离与鉴别分析,筛选出差异表达的组分,并运用质谱和生物信息学技术进行鉴定和功能识别分析。确定了宫颈炎和HSIL患者的基于蛋白质等电点和疏水性特征的血浆低丰度蛋白质组图谱,筛选出10个差异表达蛋白组分。结果表明,在HSIL患者血浆中3个低丰度蛋白组分含量明显上升,1个组分含量下降;而通过质谱技术鉴定出31种蛋白质,其中4种蛋白质与肿瘤进程密切相关,分别是代谢相关蛋白(APOA1)、信号转导相关蛋白(mTOR、EphA3)和免疫功能相关蛋白(HLA-DQB1)。本文针对维吾尔族妇女这一宫颈癌高发人群,展开癌前病变患者血浆低丰度蛋白组表达水平的研究,鉴定出多种差异表达血浆蛋白预警标志物,为本区宫颈癌的预防和早期鉴别诊断及癌变机制研究提供了依据。     

条斑紫菜ACEI肽结构鉴定与性能试验

对条斑紫菜蛋白酶解获得的血管紧张素转换酶抑制肽(ACEI)进行纯化和结构鉴定,并研究了条斑紫菜ACEI肽体外贮存稳定性和对原发性高血压大鼠的降血压作用.结果表明:通过2步反相高效液相制备色谱纯化得到2种单一组分ACEI肽,经液质联用质谱分析肽序列分别为Cys-Ser-Asn-Arg和Pro-Cys-His-Trp,二者对血管紧张素转换酶半数抑制浓度分别为24.71和5.38 μmol·L-1;条斑紫菜ACEI肽不耐高温,在中性或酸性条件下较稳定;用分子质量小于3 ku条斑紫菜ACEI肽组分对原发性高血压大鼠灌胃后有显著降血压效果,且降血压幅度随灌胃剂量增大而提高.     

聚苯乙烯为致孔剂的分子印迹膜对溶菌酶吸附性能的研究

探索聚苯乙烯微球的添加对于分子印迹膜对溶菌酶(Lysozyme, Lyz)吸附性能的影响.以溶菌酶为模板分子,丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺为功能单体、聚苯乙烯(Polystyrene,PS)微球为致孔剂,制备聚苯乙烯为致孔剂的分子印迹聚合物膜(PS-MIP).PS-MIP的吸附平衡时间为30 min,短于未添加聚苯乙烯微球的分子印迹聚合物膜(MIP);PS-MIP与MIP对于Lyz的吸附能力均明显好于聚苯乙烯为致孔剂的非分子印迹聚合物膜(PS-NIP)与未添加聚苯乙烯微球的非分子印迹聚合物膜(NIP);PS-MIP对Lyz的选择性要好于MIP,而卵清蛋白和牛血清白蛋白在PS-MIP和MIP上的荧光信号没有差别.实验结果表明,在分子印迹膜聚合过程中添加聚苯乙烯微球,有利于缩短吸附时间,增大溶菌酶的吸附量并提升选择性.     

胡萝卜籽抗氧化肽的分离纯化及活性研究

采用凝胶过滤色谱Sephadex G-50和反相高效液相色谱对胡萝卜籽中的抗氧化肽进行分离纯化.以DPPH自由基(2,2-二苯基-1-苦肼基)清除率为指标,测定多肽的抗氧化活性.采用电喷雾电离质谱法测定该多肽的相对分子质量.研究结果表明:经过分离纯化,得到一个具有较强抗氧化活性的多肽,在质量浓度为1 mg·m L-1时,其DPPH自由基清除活力达到(92.02±0.47)%,相对分子质量为339.3 u,由3个氨基酸残基组成.     

穿膜肽TAT-PTD的固相合成及其与DNA相互作用的研究

通过N-芴甲氧羰基(N-fluorenylmethoxycarbonyl,Fmoc)作为α-氨基的保护基,以逐个延伸的固相合成法合成TAT-PTD多肽,运用高效液相色谱和质谱鉴定合成多肽的纯度和相对分子质量。通过紫外吸收光谱和琼脂糖凝胶电泳阻滞实验研究合成的TAT-PTD多肽与质粒DNA相互作用,实验表明TAT-PTD多肽与质粒DNA可以通过静电作用相互吸引、靠近并结合,于是为下一步小单孢菌基因工程的细胞转导提供了依据。     

多级色谱纯化牛胎盘免疫调节多肽及性质测定

使用DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换色谱、Sephadex G-25 凝胶色谱和Sephasil C18反相高效液相色谱等分离纯化技术,采用体外培养淋巴细胞增殖试验,从牛胎盘提取液中分离出了具有免疫调节活性的多肽。免疫调节多肽对淋巴细胞增殖的促进作用具有剂量依赖性。纯化后的免疫调节多肽经过毛细管电泳(CE)鉴定为单一组分。毛细管等电聚焦电泳(CIEFE)测定多肽的等电点是3.82。基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定多肽的相对分子质量为2134。蛋白质测序仪测定多肽的序列为Tyr-X-Phe-Leu-Gly-Leu-Pro-Gly-X-Thr。     

液质联用研究人重组干细胞因子一级结构

通过高效液相色谱(HPLC)和质谱技术,对人重组干细胞因子(rhSCF)分子进行分析,以确证其一级结构.将rh-SCF样品胰酶酶切,HPLC-RPC分离,基质辅助激光解吸附电离-飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF-MS)对rhSCF的酶切肽段进行解析,并对rhSCF的O-糖基化和N-糖基化位点进行了分析.结果:(1)rhSCF分子质量得到测定;(2)rhSCF的一级结构得到确认,测定的肽质量谱的覆盖率达到94%,分子中有两对二硫键;(3)鉴定了样品中的N-糖基化位点,并对rhSCF产品的O-及N-连接糖型上的糖结构进行初步探讨.结果显示:rhSCF一级氨基酸序列和二硫键形成位置与理论上一致,糖基化特性符合毕赤酵母表达蛋白的糖基化特点.     

Identification of two-dimensional electrophoresis-separated proteins in human hepatoma cell by electrospray ion trap mass spectrometry

As one of the most important analytical methods in proteome research, mass spectrometry was utilized to identify proteins separated by two-dimensional electrophoresis in the human hepatoma cell line BEL-7404. The protein spots were excised from the gel, followed by in-gel digestion, and the peptide mappings were analyzed by liquid chromatography electrospray ion trap mass spectrometer. Nine proteins were identified via database searching, according to the molecular weights and amino acid sequences of peptides, among which two proteins have not been identified in the other liver-cell database. The sequence coverage was 21% –72%. Furthermore, the relationship between the expressed proteins and the liver carcinoma was discussed.     

蜜环菌胞外多糖的分离纯化及其性质研究

从蜜环菌发酵液提取粗多糖,经分离纯化得到多糖-A和多糖-B两个组分,快速纯化系统(FPLC)和电泳法鉴定各自为均一的组分。FPLC法测定A组分的分子量分别为2.0×105,苯酚-硫酸法测得其总糖含量为86.6%,考马斯亮蓝法测其蛋白含量为12.92%,硫酸-咔唑法测其酸性多糖含量为28%,红外光谱呈现多糖吸收特征峰,含有吡喃糖苷键。β-消去反应初步证明所提取的多糖-A存在O-糖肽键。     

浅析中药注射剂的检测现状

目的:综述中药注射剂的检测状况。方法:查阅、分析、归纳有关文献。结果:中药注射剂的检测方法包括拉曼光谱法、红外光谱法、三维荧光法、气相色谱法、高效液相色谱法、气质联用技术和液质联用技术。在所有检测方法中,高效液相色谱法使用最为广泛,由于单一检测手段的局限性,联用技术已成为检测的一种必然趋势。结论:随着先进检测手段的推广,中药注射剂的质量将会上一个新的台阶。