不同电场强度和原生质体密度对马铃薯和薯蓣细胞融合效率的影响

体细胞电融合技术因其融合效率高、对细胞无毒害作用而愈来愈普遍地用于细胞工程技术操作中。为了准确地确定实验参数，试验采用一个组装的电融合仪和自制平行电极，以马铃薯和薯蓣为材料，研究了在不同原生质体密度和不同电场强度条件下的细胞融合效率。试验结果显示，以交变电场频率1．0MHz、电压140Vpp．cm-处理原生质体20－40秒，尔后施加瞬时直流高压（120kv）脉冲1－2次，可以获得73．5％─76．7％的融合细胞，其中11．5％─14．4％的融合细胞可发生正常分裂。在本试验设计范围内，电场强度对细胞融合频率的影响主要表现在融合细胞能否发生分裂，而初始融合频率在各处理间无显著差异。     

小鼠2—细胞期胚胎细胞电融合的研究

为了探索核移植克隆动物技术中的细胞融合参数，进行了小鼠２－细胞期胚细胞的电融合试验。直流电场强度为２ｋＶ／ｃｍ，脉冲过程４０μｓ时，效果较好，可以获得７０．５％的融合率和６４．５％的发育率，进一步提高电场强度，裂解死亡率也明显提高；采用非电解质溶液作为融合液。     

水稻原生质体高频分裂及基因转化

从粳稻品系８９８和籼稻不育系珍籼Ａ的悬浮细胞系中制备的原生质体，分裂频率分别达１８．９％和３５％。低压脉冲电泳仪介导外源基因转移的水稻原生质体，分裂频率也在１０％以上，转化的小细胞团中检测到外原基因Ｇｕｓ的表达，对原生质体的制备、培养及转化作了下述改进：（１）添加２μｇ／Ｌ２，４－Ｄ的Ｎ６培养基培养悬浮细胞及原生质体可获高频分裂，添加０．３μｇ／Ｌ６－ＢＡ或０．１μｇ／Ｌ ＮＡＡ不利于分裂；（２）     

影响小麦原生质体培养因素的研究

小麦胚性愈伤组织酶解５小时后，原生质体产率可达６．３×１０６ｇ．ｆｗ－１，酶种类和浓度对小麦原生质体的产率有影响小麦原生质体对不同浓度渗透剂的适应范围较广，在添加０．３ｍｏｌ·Ｌ－１０．７ｍｏｌ·Ｌ－１甘露醇、山梨醇的培养基上，存活率超过５０％所试培养基中，ＫＭ８Ｐ效果最好，实验表明可能与含丰富的附加成分有关除高浓度精胺外，小麦原生质体的存活率随腐胺、精胺浓度的增加而上升，但对原生质体的分裂频率影响不大在上述最佳条件下，小麦原生质体在培养３５天后出现第一次分裂，２０天后统计分裂频率为２５．６％，３个月后植板率为２８％，并形成较多的愈伤组织     

埃斯基红豆草原生质体培养直接形成体细胞胚与再生植株

埃斯基红豆草花茎愈伤组织的原生质体在修改的ＫＭ８Ｐ和Ｖ－ＫＭ液体培养其中均能高频率地分裂和形成克隆，其分裂率为７１．４％－７６．１９％，在ＫＭ８Ｐ培养其中，原生质体经不等分裂可以直接形成体细胞胚，在Ｖ－ＫＭ培养其中形成的小愈伤组织培养也有体细胞胚的分化。     

担子菌LMPQ39与CSP的原生质体融合

本文以有抗菌作用的担子菌ＣＳＰ的高温敏感性为标记，将ＣＳＰ的原生质体与经热灭活的ＬＭＰＱ３９原生质体融合．融合条件为３０％的ＰＥＧ－６０００，３０℃温度下处理２０ｍｉｎ．融合后得稳定融合子１株（Ｆ１），融合频率为１．１×１０－４．对融合子的初步生化分析表明：其抗菌试验呈阳性；ＣＭＣ（按甲基纤维素）酶活为０．３０８Ｕ；玉米粒上生长良好；其酯酶同功酶谱异于双亲但在双亲谱带范围内，并偏近于ＬＭＰＱ３９．对其外观形态、显微结构及超显微结构的观察表明：融合子的形态结构异于亲株但遍近ＬＭＰＱ３９．     

小麦与高冰草原生质体融合及再生能力的恢复

以普通小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）济南１７７悬浮细胞来源的原生质体与高冰草（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎｅｌｏｎｇａｔｕｍ）愈伤组织来源的原生质体用ＰＥＧ法诱导融合．由于来源材料的长期继代，小麦原生质体的再生能力已很低；高冰草原生质体不能分裂；而融合产物却能高频率的分化出完整植株．融合再生植株的表型类似高冰草，染色体数目和同工酶谱亦然．但它们早期发育的模式与小麦相似．     

酵母嗜杀质粒融合转移──Ⅰ．融合转移系统的建立

以嗜杀酵母ＥＲＲ１和啤酒生产酵母ＡＳ２４２０出发菌株，建立了供体菌ＭＫ２－３：Ｋ＋Ｒ＋Ｌｅｕ－ρ＋（ｎ）和受体菌ＡＳ２４２０－１：Ｋ－Ｒ－ｌｅｕ＋ρ°（２ｎ）．对原生质体制备再生条件的研究结果表明两株菌的原生质体制备条件不尽相同；同一菌株原生质体形成与再生的最佳条件也不相同．有利于融合再生的原生质体制备条件是ＭＫ２－３：菌龄３０ｈ，蜗牛酶解量３０ｇ／Ｌ酶解时间３０ｍｉｎ，此时原生质体形成率为８０％，而再生率达１７．１％，这些条件对嗜杀活性无影响，再生菌落的嗜杀活性率达１００％；而ＡＳ２４２０－１；菌龄２４ｈ，蜗牛酶量２０ｇ／Ｌ，酶解时间３０ｍｉｎ，原生质体形成率为８１％，再生率为１８．１％．对四种渗透压稳定剂的再生效果实验表明甘露醇效果最佳，氯化钾次之，考虑到廉价，氯化钾是很好的代用品，在３０％ＰＥＧ６０００及Ｃａ２＋条件下进行原生质体融合，融合率可达８．９×１０－６，对其中的融合子ＭＡＲ４的遗传性状及嗜杀活性的稳定性检测，ＤＮＡ含量及细胞大小测定，ｄｓＲＮＡ质粒的提取及电泳结果分析和发酵性能测定，结果表明融合子ＭＡＲ４具有较高的嗜杀活性并可以稳定遗传，有与供体菌ＭＫ２－３嗜杀质粒ｄｓＲＮＡ相同的电泳行为，     

BYDV CP基因转化小麦原生质体及转基因植株再生

用原生质体融合技术与ＰＥＧ介导的直接转基因方法相结合，使高频率分裂的小麦济南１７７悬浮细胞系原生质体与具有分化能力的小麦济南１７７胚性意伤组织原生质体融合，形成具有分裂和分化能力的融合细胞；同时，利用ＰＥＧ对原生质体的直接转基因作用，将带有抗病毒基因（ＢＹＤＶＣＹｇｅｎｅ）的质粒Ｐｐｐ１５与带有抗性选择标记基因的质粒严ＰＢｌＡｃｔＳＮ导入融合细胞中．经抗性筛选获得抗潮霉素（Ｈｍ）的阳性克隆并再生植株．对再生植株作ＰＣＲ检测表明，ＣＰ基因已整合到转化植株的基因组中并稳定表达．     

细胞融合仪的研制及其在植物原生质体融合中应用的效果

当向融合小室内的电极输送一交流电场(正弦波,150—200V/cm,500kHz)以产生双向电泳后,悬浮在两个电极之间(距离200μm)的原生质体两个或几个成行排列在电极上。然后施加一高压单向脉冲(方波,850—1150V/W,80—130μs),能诱导成对的原生质体融合。我们把按此设计研制的整套装置称为细胞融合仪。菠菜、烟草、青菜和二月兰叶肉细胞的原生质体用本研制的细胞融合仪进行融合实验,获得了满意的结果,融合百分比一般超过70％,有的高达100％。这证明了该仪器性能稳定,效果良好,可用于植物细胞融合的研究。     

四季樱草叶片原生质体植株再生的研究

以四季樱草叶片为材料进行原生质体培养。使其形成再生植株．结果发现，不同的植物生长调节剂对原生质体培养和植株再生有很大的关系，其中B5培养基附加KT0．5(mg／L) 2．4-D2 甘露醇0．65有利于细胞旺盛分裂，MS培养基附加ZT3 6BA0．5有利于芽的分化．     

BYDVCP基因转化小麦原生质体及转基因植株再生

用原生质体融合技术与ＰＥＧ介导的直接转基因方法相结合，使高频率分裂的小麦济南１７７悬浮细胞系原生质体与具有分化能力的小麦济南１７７胚性愈伤组织原生质体融合，形成具有分裂和分化能力的融合细胞；同时，利用ＰＥＧ对原生质体的直接转基因作用，将带有抗病基因的质粒Ｐ＾ｐｐ１５与带有抗性选择标记基因的质粒Ｐ＾ＢｌＡｅｔＳＮ导入融合细胞中。经抗性筛选获得抗潮霉素的阳性克隆并再生植株。对再生植株作ＰＣＲ检测表明，     

高压静电场对豌豆根尖影响的细胞学研究

对经１５ｋＶ恒电场处理的豌豆根尖分生组织细胞进行了细胞学研究。结果显示经处理的根尖细胞具有不正常的细胞分裂，如频率高的多核细胞，出现频率为１．３％，同一细胞不同核的分裂不同步；多极分裂；染色体的畸变如染色体的断裂与染色体数目的减少以及微核的产生。     

葡萄原生质体分离和培养的研究

以葡萄花药诱导的胚性愈伤组织为材料,在附加5％纤维素酶(OnozukaR-10)和0.5％蜗牛酶的混和酶液中分离,获得大量具有活力的原生质体.分离的原生质体在附加2mg/L 6—BA和0.5mg/L 2,4—D的改良B_5培养基中进行液体浅层培养,原生质体能再生细胞壁、生长和分裂,形成了较大的细胞团。     

白菜型油菜原生质体培养的研究

以白菜型油菜为材料,从5日龄无菌苗的子叶和下胚轴游离原生质体,在DPD培养基中作浅层培养,密度为1×10~5个/ml。接种后48小时出现第一次分裂,6天后发生第二次分裂。此时,子叶原生质体停止发育,下胚轴原生质体可持续分裂。约一个月,形成大细胞团,转入固体培养基后可发育成愈伤组织。     

紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究

以地衣状芽孢杆菌５３－Ａ６为出发菌株，考察了各种因素对原生质体形成和再生的影响，在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，５３－Ａ６菌原生质体形成率和再生率分别达９９．７％和３０．９％，通过光学显微镜和电镜技术，观察了原生质体形成再生和原生质体聚集现象。     

紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究──Ⅱ53－A_6菌株原生质体形成及再生最佳条件的研究

以地衣状芽孢杆菌５３－Ａ６为出发菌株，考察了各种因素对原生质体形成和再生的影响．在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，５３－Ａ６菌原生质体形成率和再生率分别达９９．７％和３０．９％。通过光学显微镜和电镜技术，观察了原生质体形成再生和原生质体聚集现象。     

杨树体细胞融合研究

为克服有性杂交障碍,利用原生质体电融合技术开发杨树体细胞融合研究。本研究选择杨树不同种或无性系分离原生质体,并应用ＩＯＡ和Ｘ－射线分别对融合双亲处理,使其失去分裂能力,筛选杂种细胞,并探索杨树原生质体融合的最适电场参数与培养条件,建立杨树体细胞电融合体系。首次得到了美洲黑杨＋胡杨、青杨＋胡杨、美洲黑杨＋青杨等体细胞杂种愈伤组织。其中美洲黑杨＋胡杨、青杨＋胡杨、美洲黑杨＋青杨等体细胞杂种愈伤组织。其     

小麦与高冰草原生质体融合及再生能力的恢复

以普通小麦济南１７７悬浮细胞来源的原生质体与高冰草愈伤组织来源的原生质体用ＰＥＧ诱导融合，由于来源材料的长期继代，小麦原生质体的再生能力已很低；高冰草原生质体不能分裂；而融俣产物却能高频率的分化出完整植株。     

卵清溶菌酶激活剂的研究——Ⅲ、激活剂溶菌酶的微生物细胞脱壁效应

细胞融合是新近发展起来的生物工程技术之一,而细胞融合的主要关键步骤之一是酶法脱壁制备原生质体。早在1958年Romano等报导链霉菌属中一些种的细胞壁可以被溶菌酶溶解,Douglas首先用溶菌酶从链霉菌菌丝制备出原生质体,并用对噬菌体吸咐及血清学试验证明细胞壁确实溶解。随后Okarishi等研究了链霉菌原生质体形成和再生成细胞形态的条件。但由于不同的微生物之间的细胞壁的结构和组成有所不同,以致使它们对溶菌酶的敏感性也呈现出很大的差异,从而使溶菌酶在细胞融合中的脱壁作用受到一定的影响。前面两文已证明,激活剂LIA能