紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究

以地衣状芽孢杆菌５３－Ａ６为出发菌株，考察了各种因素对原生质体形成和再生的影响，在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，５３－Ａ６菌原生质体形成率和再生率分别达９９．７％和３０．９％，通过光学显微镜和电镜技术，观察了原生质体形成再生和原生质体聚集现象。     

酵母嗜杀质粒融合转移──Ⅰ．融合转移系统的建立

以嗜杀酵母ＥＲＲ１和啤酒生产酵母ＡＳ２４２０出发菌株，建立了供体菌ＭＫ２－３：Ｋ＋Ｒ＋Ｌｅｕ－ρ＋（ｎ）和受体菌ＡＳ２４２０－１：Ｋ－Ｒ－ｌｅｕ＋ρ°（２ｎ）．对原生质体制备再生条件的研究结果表明两株菌的原生质体制备条件不尽相同；同一菌株原生质体形成与再生的最佳条件也不相同．有利于融合再生的原生质体制备条件是ＭＫ２－３：菌龄３０ｈ，蜗牛酶解量３０ｇ／Ｌ酶解时间３０ｍｉｎ，此时原生质体形成率为８０％，而再生率达１７．１％，这些条件对嗜杀活性无影响，再生菌落的嗜杀活性率达１００％；而ＡＳ２４２０－１；菌龄２４ｈ，蜗牛酶量２０ｇ／Ｌ，酶解时间３０ｍｉｎ，原生质体形成率为８１％，再生率为１８．１％．对四种渗透压稳定剂的再生效果实验表明甘露醇效果最佳，氯化钾次之，考虑到廉价，氯化钾是很好的代用品，在３０％ＰＥＧ６０００及Ｃａ２＋条件下进行原生质体融合，融合率可达８．９×１０－６，对其中的融合子ＭＡＲ４的遗传性状及嗜杀活性的稳定性检测，ＤＮＡ含量及细胞大小测定，ｄｓＲＮＡ质粒的提取及电泳结果分析和发酵性能测定，结果表明融合子ＭＡＲ４具有较高的嗜杀活性并可以稳定遗传，有与供体菌ＭＫ２－３嗜杀质粒ｄｓＲＮＡ相同的电泳行为，     

SD—5菌株原生质体形成与再生条件的研究

探讨了培养基成分、培养时间、高渗缓冲液成分和ｐＨ、溶菌酶浓度以及酶解温度和时间对苏云金杆菌ＳＤ－５菌株原生质体形成和再生的影响；结果表明，ＳＤ－５菌株原生质形成和再生的最佳条件组合为：ＰＢＧ培养基、３０℃培养１４ｈ再活化５ｈ，以ＳＭＭｐＨ６．５作酶解缓冲液，溶菌酶浓度０．６ｍｇ／ｍｌ，３４℃处理６０ｍｉｎ。     

L-甲硫氨酸产生菌M0658原生质体形成及其再生条件的研究

以产L-甲硫氨酸芽孢杆菌M0658为出发菌株，考察了各种因素对原生质体形成和再生的影响．在原生质体形成和再生的最佳条件下，M0658原生质体形成率和再生率分别达到96．4％和75．3％，并在光学显微镜下观察了原生质体和原菌的形态差别．     

利用紫外线诱变原生质体选育糖化酶高产菌株的研究

利用紫外线诱变原生质体选育糖化酶高产菌株的研究苟兴华（生物工程系）在原生质体形成及再生的最佳条件下制备Ａ．ｎｉｇｅｒＵＶ—ＧＧ原生质体，然后对原生质体进行紫外线诱变处理。经再生培养原生质体和发酵筛选再生菌株，获得了高产稳定株Ｐ＿（４７）—３。其糖化酶...     

茴香原生质体培养研究

以茴香（ＦｏｅｎｉｃｕｌｕｍｖｕｌｇａｒｅＬ．）幼苗茎切段在ＭＳ附近２，４－Ｄ１ｍｇ／Ｌ、６－ＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ的培养基上诱导产生愈伤组织，经４～５次继代后形成胚性愈伤组织。将胚性愈伤组织转至ＭＳ＋ＮＡＡ１ｍｇ／Ｌ＋２，４－Ｄ０．５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ０．２５ｍｇ／Ｌ的液体培养基中培养，形成胚性细胞悬浮系。悬浮细胞在含有１．５％纤维素酶、１％果胶酶、０．５％蜗牛酶的混合酶液中酶解得到大量的原生质体，原生质体用修改的ＫＭ８Ｐ培养基中做液体浅层培养。２天后细胞发生一裂，两个月后形成０．５～１ｍｍ大小的小愈伤组织，转入含琼脂糖的固体培养基中３周后形成２～３ｍｍ的愈伤组织     

淀粉直接发酵酒精的菌株选育──内孢霉酵母与酿酒酵母属间原生质体融合

本研究旨在构建直接发酵淀粉生产酒精的酵母菌．选择具α－淀粉酶和葡萄糖淀粉酶活性的Ｅ．ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａＥ１１灭活的原生质体，与耐高温产酒率高的Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＨＢ－６－９单倍体进行属间原生质体融合．经３５％ＰＥＧ－５０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２诱导，在再生选择培养基上融合率１．０～１．５×１０－６，获得１２个性能稳定的融合株．部分融合株生长速度、淀粉水解能力、可溶性淀粉直接发酵酒精的能力明显高于两亲株．     

紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究：Ⅲ.诱变…

以地衣芽孢杆菌（ＢａｃｉｌｌｕｓＬｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）５３号菌为出５３－Ｇ３８－６，产酶活的最佳条件下制备原生质体，并对原生质体进行了多次诱变处理，从大量突变株进行筛选最终获得了高产、稳定、耐热的碱性蛋白酶产生菌５３－Ｇ３８－Ｋ６，产酶活力由１１０４Ｕ／ｍｌ提高到２２０８０Ｕ／ｍｌ。     

紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究Ⅲ.诱变株的选育及其产酶条件的研究

以地衣芽孢杆菌（ＢａｃｉｌｕｓＬｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）５３号菌为出发菌株，在原生质形成和再生的最佳条件下制备原生质体，并对原生质体进行了多次诱变处理，从大量突变株进行筛选最终获得了高产、稳定、耐热的碱性蛋白酶产生菌株５３－Ｇ３８－６，产酶活力由１１０４Ｕ／ｍｌ提高到２２０８０Ｕ／ｍｌ．该诱变株最适产酶条件为：培养基由质量分数（ｗ／％）为胰蛋白胨１，酵母膏０．５，玉米粉５，Ｎａ２ＨＰＯ４１２Ｈ２Ｏ０．４，ＫＨ２ＰＯ４０．０３，Ｎａ２ＣＯ３０．１组成，ｐＨ自然，培养温度４２℃，培养时间４４～４８ｈ，ｗ／％为０．２的ＣａＣＯ３可提高酶的产量．酶作用的最适条件：６２℃，ｐＨ１０．０，ｐＨ在９～１０之间稳定     

SD－5菌株原生质体形成与再生条件的研究

探讨了培养基成分、培养时间、高渗缓冲液成分和ｐＨ、溶菌酶浓度以及酶解温度和时间对苏云金杆菌ＳＤ—５菌株原生质体形成和再生的影响；结果表明，ＳＤ—５菌株原生质体形成和再生的最佳条件组合为：ＰＢＧ培养基、３０℃培养１４ｈ再活化５ｈ，以ＳＭＭｐＨ６．５作酶解缓冲液，溶菌酶浓度０．６ｍｇ／ｍｌ，３４℃处理６０ｍｉｎ．     

黑曲霉(Aspergillus niger)原生质体电融会(Ⅰ)─黑曲霉原生质体形成与再生的研究

通过紫外诱变获得两株稳定的黑曲霉营养缺陷型Ｍｕ２（Ｍｅｔ－）和Ｄ１２（Ｃｙｓ－），并首次证实低温黑暗保存数小时对黑曲霉突变株具有稳定作用。系统地研究了菌龄、渗透压稳定剂、温度、酶的浓度和酶解系统等因素对黑曲霉原生质体形成的影响．采用２％溶壁酶加０．５％纤维素酶，获得了大量的原生质体。在显微镜下观察原生质体形成和再生过程， Ｍｕ２和 Ｄ１２再生率分别为 ５４％和 ３３％。原生质体在正弦交变电场（１ＭＨｚ，４５０ Ｖ／ｃｍ）作用下形成珠串，在高压电脉冲（强度 ９．０ ｋＶ／ｃｍ、时程 ２５ μｓ）触发下，发生融合。     

出芽短梗霉的原生质体形成及再生研究

采用多因素实验正交优选法对出芽短梗霉（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍｐｕｌｕｌａｎｓ）的原生质体制备和再生条件进行了研究．发现在用ＹＥＰＤ作生长培养基,菌龄２４ｈ,复合酶处理（含０．２５％（ｗ）蜗牛酶＋０．２５％（ｗ）纤维素酶）,０．６ｍｏｌ／ＬＫＮＯ３作渗透压稳定剂的情况下,原生质体制备率最高,酶解１ｈ,制备率为１００％,再生率为０．３５％．如用ＰＤＡ为再生基础培养基,在添加５０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２,１．０％（ｗ）ＰＥＧ（ＭＷ６０００）等再生促进因子的情况下,再生率可提高到１．２３％     

影响小麦原生质体培养因素的研究

小麦胚性愈伤组织酶解５小时后，原生质体产率可达６．３×１０６ｇ．ｆｗ－１，酶种类和浓度对小麦原生质体的产率有影响小麦原生质体对不同浓度渗透剂的适应范围较广，在添加０．３ｍｏｌ·Ｌ－１０．７ｍｏｌ·Ｌ－１甘露醇、山梨醇的培养基上，存活率超过５０％所试培养基中，ＫＭ８Ｐ效果最好，实验表明可能与含丰富的附加成分有关除高浓度精胺外，小麦原生质体的存活率随腐胺、精胺浓度的增加而上升，但对原生质体的分裂频率影响不大在上述最佳条件下，小麦原生质体在培养３５天后出现第一次分裂，２０天后统计分裂频率为２５．６％，３个月后植板率为２８％，并形成较多的愈伤组织     

水稻原生质体高频分裂及基因转化

从粳稻品系８９８和籼稻不育系珍籼Ａ的悬浮细胞系中制备的原生质体，分裂频率分别达１８．９％和３５％。低压脉冲电泳仪介导外源基因转移的水稻原生质体，分裂频率也在１０％以上，转化的小细胞团中检测到外原基因Ｇｕｓ的表达，对原生质体的制备、培养及转化作了下述改进：（１）添加２μｇ／Ｌ２，４－Ｄ的Ｎ６培养基培养悬浮细胞及原生质体可获高频分裂，添加０．３μｇ／Ｌ６－ＢＡ或０．１μｇ／Ｌ ＮＡＡ不利于分裂；（２）     

酵母菌原生质体形成与再生多因子综合效应分析

研究了酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂和预处理剂对酿酒酵母Ａ００１与克鲁维酵母Ｙ０３４原生质体形成时间与再生的综合效应．统计分析表明，在２％蜗牛酶，菌龄为对数生长期时，影响原生质体形成的主要因素是酶解时间、酶解温度，且两者存在交互作用．影响原生质体再生的主要因素是渗透压稳定剂．确立了实验菌株原生质体形成与再生的最佳匹配条件     

平菇原生质体制备、再生及灭活研究

紫孢侧耳、糙皮侧耳和佛罗里达侧耳的原生质体制备与再生的最佳条件为：用１％溶壁酶＋０．５％蜗牛酶的混合酶液酶解培养３～４天的菌丝体，１．５小时后，原生质体产量均可达１０￣（１０）个／Ｌ；三种侧耳的最佳再生培养基分别为ＳＭ、ＭＰ和ＲＰ，再生率分别为０．６１％、０．６７％和０．７６％。随着紫外线对原生质体处理时间的加长，再生率逐渐下降，当处理４ｍｉｎ时，再生率接近零。     

异常汉逊酵母原生质体形成和再生研究

采用多因子正交实验确定了一株异常汉逊酵母(Hansenula anomala)原生质体形成和再生的最佳条件。对数前期细胞在1％蜗牛酶、0.1％巯基乙醇(ME)。0.1％EOTA,0.9mol.l~(-1)甘露醇和pH5.4,35℃条件下处理30分钟,原生质体形成率和再生事分别为91.4％和9.31％,原生质体形成率×再生率值最大(8.51％)。     

苦瓜叶肉原生质体的培养

将从苦瓜无菌种子苗幼叶分离的原生质体，培养在以ＤＰＤ为基本成分并添加了２，４－Ｄ，６ＢＡ和ＺＴ各０．５ｍｇ／Ｌ的ＰＤ培养基中，形成了小愈伤组织。     

电场诱导酵母菌原生质体融合的研究──原生质体分离、电融合条件及其机制的研究

研究了热带假丝酵母野生株１０４５及其突变株ＳＤ１的原生质体分离、电击诱导融合的诸条件以及融合子的再生。得出了原生质体的最佳生成条件。用９９９ｋＨｚ，２４０～４００ Ｖ／ｃｍ的高频交变电场使原生质体横向电泳形成珠串，以脉宽 ４０ μｓ，幅值 １６００～２ ８００ Ｖ／ｃｍ的直流脉冲可使原生质体融合，净融合率达６５％。采用较低幅值的多个脉冲有利于融合。电击液中加入ＣａＡｃ场、ＭｇＡｃ２及白蛋白可大大提高融合率，用光刻镀金方法设计了适用于微生物的多电极融合小室。对膜融合机制进行了探讨。     

紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究…

从土壤中筛选到一株嗜碱性地衣芽孢杆菌５３－Ａ６．，该菌株能在ｐＨ１０以上６０℃的环境中良好生长，４５℃ｐＨ９￣１２的条件下均可产生活力较高的碱性蛋白酶，酶反应的最适条件：６０℃，ｐＨ１０￣１１，在ｐＨ８．５￣１１之间较稳定。６０℃保温１ｈ剩余酶活在２０％以上。