涉案偶蹄目动物DNA条形码构建

【目的】利用线粒体DNA条形码标记鉴定涉案偶蹄目动物,为解决偶蹄目动物残体、制品的鉴定难题提供技术参考。【方法】对16个偶蹄目动物物种共67份样本,采用试剂盒提取DNA,扩增、测定物种的线粒体DNA的COI基因、Cyt b基因片段;在GenBank上Blast搜索进行同源性分析;利用MEGA 7.0软件分别比较这两个基因片段种内和种间遗传距离,构建系统发育树。【结果】在同源性分析中,西伯利亚狍(Capreolus pygargus)的Cyt b基因片段与GenBank中西伯利亚狍、欧洲狍(Capreolus capreolus)基因序列的同源性均为99.64%~99.82%,该片段不能区分西伯利亚狍与欧洲狍这两个近缘种。其余测序结果与数据库中参考序列一致且相似度较高。对于COI片段,种内遗传距离为0~1.4%,种间遗传距离为1.8%~18.8%。对于Cyt b基因片段种内遗传距离为0~0.5%,种间遗传距离为4.0%~15.8%。两个片段的种内遗传差异均小于种间遗传差异,存在较为明显的条形码间隔。COI和Cyt b基因片段的系统发育树中,同物种的不同个体均能形成具有较高支持度的单分支;不同物种之间界限清晰,每个物种的所有个体均能够形成具有较高支持度的单分支。【结论】基于COI和Cyt b基因片段构建的DNA条形码均可用于对涉案偶蹄目动物的物种鉴定。在物种鉴定中,可采用两个片段联合使用的方式,尤其是对于近缘种的鉴定,以降低错误风险。     

黄河鮈Cytb基因克隆及其在鮈属中的系统发育

采用聚合酶链式反应克隆黄河鮈线粒体细胞色素b基因 (Cyt b),首次报道了该基因的全长序列(1140bp,FJ904648) ,并与鮈属中其他6个物种的Cyt b 基因进行同源性比较,分析了碱基组成和变异情况,以马口鱼属的马口鱼和鯝属的云南鯝作为外群构建了ML和NJ系统发育树.遗传距离和分子系统学分析表明,黄河鮈与犬首鮈具有较低的遗传距离(6.30%),在系统发育树上两者聚在一起,提示黄河鮈与犬首鮈存在较近的亲缘关系.     

细胞色素b基因序列变异与东亚 科鱼类系统发育

采用PCR技术获得了中国 科鱼类线粒体DNA细胞色素b基因1138bp全序列，所得序列与GenBank中分布于日本，韩国和俄罗斯的 科2属9种鱼类同一基因序列排序，并选用鲇形目鲇科的大口鲇，钝头Wei科的鳗尾 以及脂鲤目的断线脂鲤作外类群，分析了细胞色素b基因序列，计算了Kimura双因子遗传距离和 科鱼类线粒体DNA的进化速率，用最是约法和邻接法构建了 科鱼类分子系统树，得出如下结论：（1）线粒体DNA序列分析显示所测定的鲇形目鱼类细胞色素b基因序列中，存在3bp的缺失。（2）系统发育分析示 科构成一单系类群； 属为较为特化的属，拟 属为一明显的类群，而黄颡鱼属与Wei属关系较为混乱；（3）东亚 科鱼类线粒体DNA的进化速率约为每百万年0.18%-0.30%,本文是中国鲇形目 科鱼类线粒体DNA细胞色素b基因序列的首次报道。     

基于Cyt b基因序列变异探讨鲱形目系统发育关系

鲱形目内科间分类关系一直以来存在较多争议,为探讨鲱形目系统发育关系,对黄鲫、凤鲚的线粒体Cyt b基因全序列进行扩增、克隆及测序,得到1 141 bp序列。结合Genbank中已发布的鲱形目鱼类Cyt b基因全长序列利用生物信息学软件进行比较分析后,共检测到553个变异位点,总变异为48.5%,其中含504个简约信息位点,未见序列插入或缺失。碱基的替换多在密码子第三位,序列中转换多于颠换,Ts/Tv为2.448,基因突变未达到饱和。基于K2P模型计算的遗传距离表明,宝刀鱼科同鲱科及鳀科的科间遗传距离(0.042~0.072)小于鲱科内属间遗传距离(0.065~0.106)。在以南美肺鱼为外群构建的NJ分子系统树中,齿头鲱科最先分化,是鲱形目中原始类群;鳓属、多齿鳓属独立聚为一支,且具较高的自举检验值,支持将其归入锯腹鳓科;宝刀鱼科并入到鲱科一支中去,与鲱科亲缘关系更近。     

利用细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(CO Ⅰ)基因鉴定宠物仓鼠

为探究DNA条形码技术在商品宠物仓鼠的品系鉴定中的可行性,以金丝熊、虎纹熊、眼圈熊、奶牛熊、银狐、紫仓、奶茶、布丁、老婆婆共9个品系36只宠物仓鼠为动物材料,无损取材后,提取基因组DNA,利用特异性引物对线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因进行PCR扩增测序,通过遗传距离和系统进化分析鉴定仓鼠的物种分类.结果显示:1)36个样本均成功扩增出长度为750bp左右的COⅠ基因片段;2)宠物仓鼠中的熊类均属于中仓鼠属(Mesocricetus)物种,其他品系则分属于毛足鼠属(Phodopus)和仓鼠属(Cricetulus)的4个物种,各品系之间谱系混乱.本研究认为,COⅠ基因是适宜于物种鉴定的分子标记,但对宠物仓鼠品系的鉴定和区分能力不足.     

细胞色素b基因序列变异与东亚鲿科鱼类系统发育

采用PCR技术获得了中国（鱼尝）科鱼类线粒体DNA细胞色素b基因1138bp全序列.所得序列与GenBank中分布于日本、韩国和俄罗斯的（鱼尝）科2属9种鱼类同一基因序列排序,并选用鲇形目鲇科的大口鲇、钝头（鱼危）科的鳗尾（鱼央）和伦氏（鱼央）以及脂鲤目的断线脂鲤作外类群.分析了细胞色素b基因序列,计算了Kimura双因子遗传距离和（鱼尝）科鱼类线粒体DNA的进化速率,用最大简约法和邻接法构建了（鱼尝）科鱼类分子系统树,得出如下结论:(1)线粒体DNA序列分析显示所测定的鲇形目鱼类细胞色素b基因序列中,存在3bp的缺失;(2)系统发育分析显示（鱼尝）科构成一单系类群;（鱼艹）属为较为特化的属,拟（鱼尝）属为一明显的类群,而黄颡鱼属与（鱼危）属关系较为混乱;(3)东亚（鱼尝）科鱼类线粒体DNA的进化速率约为每百万年0.18%～0.30%.本文是中国鲇形目（鱼尝）科鱼类线粒体DNA细胞色素b基因序列的首次报道.     

蓝鳃太阳鱼与绿色太阳鱼细胞色素b(Cyt b)基因序列片段分析

用酚/氯仿提取法提取了蓝鳃太阳鱼、绿色太阳鱼肌肉组织的总DNA,利用特异引物进行PCR扩增,得到1 119bp Cyt b基因片段,纯化后送上海生工测序。所得序列用Mega3.1软件分析,并结合GenBank中其余9种太阳鲈属鱼类Cyt b基因序列用NJ法构建太阳鲈属鱼类系统发育树。结果表明：（1）蓝鳃太阳鱼与绿色太阳鱼序列相似度为82.3%,变异位点198个,平均转换/颠换比为2.1;（2）蓝鳃太阳鱼与L.humilis亲缘关系较近,绿色太阳鱼与L.symmetricus亲缘关系较近,蓝鳃太阳鱼与绿色太阳鱼遗传距离为0.206。     

海南产花鳗鲡细胞色素b基因的克隆及序列分析

线粒体细胞色素b基因是目前研究鱼类分子系统进化的重要分子标记.笔者以日本鳗鲡线粒体基因组序列为模板设计并合成引物进行PCR扩增,并将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和纯化后,克隆到pMD18-T载体、测序,成功得到全长为1 140 bp的海南产花鳗鲡细胞色素b(Cyt b)基因序列.将该基因全长序列递交到Genebank数据库,获得序列登录号为EF690363.用DNA分析软件MEGA2比较了海南产花鳗鲡与递交到GenBank中的8种分布在中国东南沿海、日本海域及南太平洋海域的鳗鲡属(Anguillia)细胞色素b基因的地理差异,并构建了系统进化树.结果显示:日本产和夏威夷产花鳗的地理差异小于海南产花鳗与它们之间的地理差异.     

青海省都兰县羊亚科野生动物残体的分子鉴定

DNA条形码(DNA barcode)已被广泛用于野生动物的物种鉴定、身份识别、系统发生等领域的研究。本研究利用DNA条形码技术对青海省都兰县宗加镇收集到的羊亚科野生动物残体进行了分子鉴定。结果表明:在13份羊亚科野生动物残体中成功获得3个样品的细胞色素b(Cytochrome b,Cyt b)基因全长序列,通过生物信息学和系统发育关系分析显示,来自野外分化头骨齿髓和1份皮张样品的Cyt b基因序列与盘羊的基因序列聚在一起,结合都兰县羊亚科动物的分布格局,推测这2个样品可能属于盘羊组织;而来自腿骨骨髓的Cyt b基因序列与岩羊已发表序列聚在一起,共同形成一个单系群,推测腿骨样本可能属于岩羊个体。研究结果揭示,无论是从序列差异还是系统发育关系,细胞色素b基因序列作为DNA条形码均可确切鉴定羊亚科的物种。     

基于线粒体DNA序列分析研究泰山赤鳞鱼的分类和进化

泰山赤鳞鱼作为一种古老而分布特异的鲤科鱼种,其分类和进化地位尚存在很多争议.利用PCR方法克隆了泰山赤鳞鱼线粒体DNA的12S,16SrRNA、细胞色素b和ATP酶8/6基因序列,分析了碱基组成变异和核苷酸序列差异,并与鲤科其它属种的同源序列进行比较,发现所有基因都是(A+T)%(G+C)%.蛋白编码基因在第三位点是G缺失基因,并集中在第三位点发生替换突变.利用最小进化法(ME)和邻接法(NJ)构建了系统进化树.结果表明,泰山赤鳞鱼不属于突吻鱼属,而是更接近倒刺鲃属和鲃属.利用细胞色素b序列计算并推断泰山赤鳞鱼可能起源于1 600万年前的中新世中期.     

淡水鱼类线粒体DNA D-loop基因的引物设计和应用

 线粒体DNA测序已广泛应用于鉴定和区分种类以及解决系统进化关系问题。本文选取已测定的主要淡水鱼类的线粒体DNA D-loop基因序列进行同源性比较,寻找保守序列,利用简并性原则设计一对通用的简并引物。利用设计的引物对广东省珠江流域主要的淡水鱼类线粒体DNA D-loop控制区基因进行扩增,均能获得单一的目的DNA片断,特异性扩增产物大小为1 kb左右。经测序及与GenBank同源序列的比较,证实为包含线粒体控制区全序列的扩增产物。本研究所设计的引物和应用的方法可以快速地同时对多种鱼类进行大规模的遗传背景分析,鉴定某些难于鉴别的近缘物种,为我国鱼类的种类鉴定、地理种群鉴别及种质资源的评估提供重要的工具。     

2种三疣梭子蟹居群线粒体Cyt b和S-rRNA基因片段序列变异研究

目的：通过对2种三疣梭子蟹居群样线粒体C弘b和S-rRNA基因片段的序列分析,探讨其遗传变异,为种质资源的管理、保存和利用提供依据．方法：采集山东潍坊和福建厦门两个不同居群的三疣梭子蟹样,提取其线粒体DNA．由Genebank获得三疣梭子蟹完整线粒体DNA序列（登陆号：NC_005037）,设计扩增Cyt b和S-rRNA基因片段引物,经PCR扩增获得预期产物,纯化后测序．结果：以提取的线粒体DNA为模板扩增出特异性强的Cyt b和S-rRNA基因片段,与预期条带长度429bp和465bp吻合;2个基因片段的AT含量均高于GC含量;Cyt b基因片段有3个位点发生了突变,S-rRNA只有1个位点发生了突变;在两种居群的4个突变位点中,2个位置突变为相同的碱基,且所有突变位点均呈转换方式．结论：Cyt b基因序列比S-rRNA基因序列具有相对高的突变率;研究的2个基因片段的突变位点的碱基置换主要呈转换方式;来自2个三疣梭子蟹居群样本的线粒体S-rRNA基因的突变发生在同一位点且突变为相同碱基,表明2个居群具有较近的亲缘关系．     

苏姜猪线粒体基因组全长测序及线粒体基因多样性分析

从分子水平上探究苏姜猪的遗传多样性,采用二代测序方法测定了苏姜猪线粒体基因组全序列,整合NCBI数据库中已公布的家猪类,以及本实验室测定的苏姜猪线粒体基因组全序列,使用蛋白编码基因和rRNA基因联合的数据集,基于贝叶斯法(BI法)和最大似然法(ML法)构建了家猪类的系统发生树,测序结果表明,该样本线粒体基因组全长15 436 bps,包含典型的家猪类线粒体基因组37条基因,结构紧凑,其线粒体基因组碱基组成(A+T)约占40%,(C+G)约占60%,t RNA总共有8处错配,结果表明苏姜猪具有丰富的遗传多样性,江海型线粒体核苷酸多态性高于全国6个类型猪的平均水平,体现了其独特的遗传多样性.在基于线粒体基因组完整编码区的系统发育分析中,苏姜猪在中国6个类型家猪中单独成为一支,支持其作为一个新猪种而存在.     

基于Cytb和COⅠ基因序列的蟒蛇分子鉴定

基于线粒体细胞色素b(Cyt b)和细胞色素c氧化酶亚单元Ⅰ(COⅠ)片段,分析比较了蟒蛇(Python molurus)不同地理种群间的序列差异.通过PCR扩增和序列测定,得到蟒蛇线粒体2个基因片段的总长度分别为1 200 bp(Cyt b)和1 100 bp(COⅠ),其两个基因序列中碱基G含量明显低于其他3种碱基,基因片段的A+T含量都较高.用MEGA4.0软件中的NJ法和UPGMA构建系统树.以红尾筒蛇(Cylindrophis ruffus)作为外群,对福州动物园的5个蟒蛇样品和NCBI上检索的样品进行遗传距离的测算,从遗传距离上来看:有两个群体间的遗传距离很近,一个是Fuzhou1、Fuzhou4和金门蟒蛇种群;另一个是Fuzhou2、Fuzhou3、Fuzhou5、缅甸蟒蛇种群和越南蟒蛇种群;印度蟒蛇种群Python molurus molurus(HM581978)与上述两个群体间遗传距离次之,外群与其他样品距离最远.对5个蟒蛇样品和NCBI上检索的样品物种构建的系统树显示:Cyt b与COⅠ基因所构建的进化树基本一致,Fuzhou2、Fuzhou3、Fuzhou5与缅甸蟒蛇、越南蟒蛇为一支,为东南亚种群,与福建种群Fuzhou4、Fuzhou1、金门蟒蛇种群形成姐妹支,然后与印度种群Python molurus molurus(HM581978)聚到一起,构成大支.实验结果表明福州动物园的蟒蛇是福建本地种群和东南亚种群混养的.     

高原鳅属鱼类线粒体全基因组序列结构特征及其系统发育信息

为了深入开展高原鳅属(Triplophysa)鱼类的分类鉴定、系统进化等研究,利用生物信息学的方法分析了37种高原鳅属鱼类的线粒体全基因组序列及系统发育信息。通过Clustal X对线粒体DNA(mt DNA)全基因组序列进行对比,然后用MEGA7分析mt DNA的序列差异,并用邻接法生成系统进化树。结果发现:(1)高原鳅属鱼类线粒体基因组的全长在16 562～16 681 bp之间,其基因组结构和基因排列顺序与其他硬骨鱼类的线粒体基因组特征相同;(2)在所有编码基因中,ND2基因的序列变异程度最大(52.5%),且Kimura双参数(K2P)遗传距离最大(0.232),而16S rRNA的变异程度最小(19.9%),12S rRNA基因的K2P遗传距离最小(0.034);(3)系统进化树显示高原鳅属中除叶尔羌高原鳅(Triplophysa yarkandensis)外,绝大多数物种能够聚为一支,未描述种(T.sp.)、玫瑰高原鳅(T.rosa)和湘西盲高原鳅(T.xiangxiensis)聚为一支并处于该属的基部位置。     

中国南方沿海13种石斑鱼类的分子系统进化关系分析

石斑鱼类(Groupers)是世界性海洋经济鱼类,也是中国南方沿海省份重要的海水增养殖对象,其种类繁多,由于缺乏明显的种间外部形态区别特征,石斑鱼的分类一直是鱼类系统分类学的一个难题,存在着较多的争议和混淆。为了从分子水平揭示石斑鱼类的系统进化关系,应用线粒体细胞色素b基因(Cyt b)及两个核糖体RNA基因(16S和12S)序列联合构建系统进化树对中国近海石斑鱼亚科3属13种进行种类鉴定及亲缘关系分析,探讨了石斑鱼类的分子系统进化。结果表明:①线粒体基因序列在石斑鱼类种间存在较大的变异,种内变异极小,是进行石斑鱼类种类鉴定较为适宜的分子标记;②所研究的3属13种石斑鱼类中,石斑鱼属与九棘鲈属的亲缘关系较近,与鳃棘鲈属的较远;③赤点石斑鱼和青石斑鱼、蜂巢石斑鱼与鲑点石斑鱼、斜带石斑鱼与棕斑石斑鱼两两间具有较近的亲缘关系。     

等边浅蛤线粒体全基因组测序和系统发育研究

采用高通量测序技术对等边浅蛤的线粒体全基因组进行了测序,并通过拼接、组装得到了完整的线粒体基因组序列。研究结果表明:环状线粒体基因组总长度为20 248 bp,由13个蛋白编码基因,22个tRNA基因,2个rRNA基因及1个控制区组成,所有基因均在重链编码。等边浅蛤线粒体基因碱基组成为A(28.55%),T(39.33%),C(10.40%)和G(21.72%),A+T含量为67.88%,具有AT偏好性。D-loop控制区位于COX1基因和Cytb基因之间,长度为1 944 bp。利用帘蛤科16个物种及缢蛏(外群)的线粒体基因组的12个蛋白质编码基因构建NJ系统进化树。结果表明,等边浅蛤与菲律宾蛤仔聚为一支,亲缘关系最近。该研究将补充浅蛤属线粒体基因组信息,为浅蛤属以及帘蛤科的系统发生关系及进化地位积累有价值的数据资料。     

赤眼鳟线粒体D-loop和Cyt b基因序列的对比分析

 研究了长江和珠江野生赤眼鳟Squaliobarbus curriculus共4个群体24个个体的线粒体控制区（D-loop）和细胞色素b（Cyt b）基因序列,通过PCR扩增与测序,分别获得了长度为598 bp和752 bp的D-loop和Cyt b基因片段。分析表明,D-loop序列共定义了18个单倍型,存在34个简约信息位点,67个多态性位点,发生转换40次,颠换15次,插入/缺失14次。A、T、C、G平均含量分别为33.7%、35.1%、17.5%、13.7%。Cyt b序列共定义了18个单倍型,存在68个简约信息位点,72个多态性位点,发生转换60次,颠换15次,无插入/缺失位点。A、T、C、G平均含量分别为29.3%、26.4%、29.8%、14.5%。Cyt b除简约信息位点百分比大于D-loop外,多态位点百分比和单突变位点百分比均小于D-loop,说明D-loop具有较快的进化速率。D-loop序列的单倍型多样性(H)、平均核苷酸差异数(K)、核苷酸多样性(π)分别0.963 8、16.543 5和0.028 4,Cyt b的H、K和π分别为0.971 0、31.855 1和0.042 6,显示赤眼鳟具有较高的遗传多样性水平,且遗传变异主要存在于群体间。分析群体间的遗传距离和F_ST值,D-loop和Cyt b都一致表明：长江和珠江水系间存在明显的遗传分化,系统树和分子变异等级分析(AMOVA)也支持这一观点。同一水系群体间的遗传差异较小,Cyt b则更小;不同水系群体间的遗传差异较大,Cyt b则更大。故,Cyt b呈现出“小则越小,大则越大”的态势。分析其原因,可能与D-loop和Cyt b进化速率密切相关。     

北江流域侧条光唇鱼(Acrossocheilus parallens)的遗传多样性及核型分析

为了解侧条光唇鱼(Acrossocheilus parallens)的遗传多样性及染色体核型,文章通过传统形态学及框架结构测量研究北江侧条光唇鱼的形态学特征,活体注射植物凝集素(PHA)和秋水仙素研究其染色体核型,对线粒体DNA扩增及测序研究其遗传多样性。形态学结果显示,该群体的可数性状及可量性状与《中国动物志》存在一定的差异,如：可数性状中胸鳍鳍条数为12～14,而《中国动物志》中为14～16;可量性状中体长/体高、体长/头长、头长/吻长的比值均明显大于《中国动物志》中所描述的比值。Pearson相关分析表明,10项可量性状和17项框架结构性状均与体重呈极显著正相关(P<0.01)。侧条光唇鱼的核型公式为2n=14m+16sm+8st+12t,染色体臂数NF=80,未发现异型性染色体。侧条光唇鱼线粒体Cyt b基因与D-loop序列分析显示,碱基A+T含量均高于C+G含量,且G含量最低,表现出明显的碱基偏倚性。基于D-loop序列和Cyt b基因各单倍型之间的遗传距离分别为0.001～0.004和0.001～0.003,表明该群体各单倍型之间的遗传距离很近。D-loop序列和C...     

中华鳖病原维氏气单胞菌的分子鉴定及分子分类学研究

气单胞菌是一类人和水产经济动物的严重致病菌,用分子进化手段鉴定一株分离自红脖子病甲鱼病灶部位的菌HBJY01,同时探讨气单胞菌的进化地位.克隆HBJY01的16S rRNA和gyrB基因,鉴定该菌的属种.用16S rRNA和gyrB基因通过构建系统进化树和计算序列两两间遗传距离的方法,探讨气单胞菌的进化地位.HBJY01的16S rRNA和gyrB基因与维氏气单胞菌的相应基因同源性最高,经分子鉴定为维氏气单胞菌.气单胞菌应独立于弧菌科,单独形成一个科,即气单胞菌科(Aeromonadaceae).