穿山龙薯蓣皂甙次生代谢合成相关新基因的克隆和分析

穿山龙植物根进行的特定发育过程在药用次生代谢物——薯蓣皂甙生物合成和累积中发挥重要作用.为从穿山龙根中分离出薯蓣皂甙生物合成相关基因,利用抑制性消减杂交(SSH) 和SMART技术,构建了3年生和1年生穿山龙（Dioscorea nipponica）根组织mRNA群体间正向差减cDNA文库.从该文库中随机挑选了34个cDNA克隆进行酶切、测序和序列同源性比较分析.结果表明：其中25个cDNA克隆代表了新的EST序列,对其中6个克隆在3年生根组织的表达进行了半定量PCR和定量PCR分析,分别命名为DNR     

应用抑制性消减杂交技术构建人肝癌组织特异表达cDNA文库

为克隆和筛选肝癌特异表达基因.应用抑制消减杂交技术对肝癌及癌旁组织进行消减杂交,产物PCR扩增后,进行克隆.共得到1820个克隆,1776个克隆有100~800bp的插入片断,阳性率达98%,说明人肝癌组织特异表达cDNA消减文库构建成功,同时我们对cDNA克隆进行测序,证明这些克隆的功能是和肝癌的发生高度相关的.抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法.     

硬叶兜兰花芽SSH文库的构建

以硬叶兜兰花芽cDNA为Tester,营养芽cDNA为Driver,利用SMART策略构建了硬叶兜兰花芽的抑制性消减杂交(SSH)文库.通过PCR对文库中插入的片段进行检测后,筛选了288个插入片段为500bp以上的克隆进行测序.测序结果去除载体序列后聚类得到18条差异表达片段,用BLAST进行比对分析表明,这些差异表达基因所编码的蛋白与光合作用、合成代谢、基因调控等功能有关,其中包括多个转座子和反转录转座子的同源基因.     

杨树抗杨四瘿螨相关基因的表达分析

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,在构建杨四瘿螨诱导差异表达的抑制消减cDNA文库的基础上,通过RTPCR技术对候选基因进行了验证,其中有6条差异表达候选基因在4个时间点表达量有明显的增强。运用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术克隆获得了一段全长2 053 bp的cDNA克隆,命名为PtWRKY,编码588个氨基酸。     

西藏胡黄连根状茎差异表达基因的筛选及分析

 西藏胡黄连是著名的濒危西藏药材, 其粗壮的根茎部是重要的合成和储存药用萜类物质器官,萜类含量显著高于叶部。为克隆西藏胡黄连根状茎和叶的差异表达基因,利用抑制消减杂交技术,构建了根状茎特定的抑制消减文库。从该SSH文库中随机挑取片段不一的阳性克隆测序,采用Blastx进行同源比对,获得了27个表达序列标签（EST）,并获登录号。序列统计分析结果表明,其中有11个EST在GenBank中无同源性序列,推测可能是新基因片断。蛋白质功能分类结果表明,这些蛋白质与翻译、能量代谢、转运与结合、细胞膜合成、氨基酸生物合成及中间代谢6大类蛋白功能有关。为深入研究与萜类生物合成直接或间接相关基因,选择了长595 bp的差异表达EST序列EX172715进行了同源比对和蛋白系统进化分析。结果表明,EX172715具有细胞色素P450单加氧酶的特征结构,与拟南芥的细胞色素P450单加氧酶蛋白的同源性高于水稻和小麦。提供了一组与西藏胡黄连次生代谢相关的新基因库。     

胎儿左右大脑差异表达基因片段的克隆

应用抑制性消减杂交（ＳＳＨ）技术从一２４ 周流产男性胎儿的左右大脑ｍ ＲＮＡ 中克隆到了４２ 个左脑特异表达基因的ｃＤＮＡ 片段，并随机挑选１５ 个克隆的测序结果与美国ＮＩＨ 基因库ＥＳＴ进行了同源性分析，同源性范围是６４％ ～１００％ ，其中有５ 个克隆的基因库同源序列与脑有关，其余１０ 个克隆同源于脑以外的其它组织．     

穿山龙液泡H+-ATPase c亚基基因片段的克隆

利用抑制消减杂交（SSH）和SMART技术，构建了3年生和1年生穿山龙（Dioscorea nipponica）根组织mRNA群体间正向差减cDNA文库．从34个随机测序的cDNA克隆中，发现了1个编码液泡H^＋-ATPase（V-H^＋-ATPase）c亚基的克隆，并命名为DnvHAc1（Accession No：DN792564）．序列同源性分析表明，其cDNA序列长486bp，3’端具有PolyA结构，其编码的氨基酸序列（115个氨基酸残基）也与多种植物的液泡H^＋-ATPase c亚基（16kDa proteolipids）具有较高同源性，具有3个跨膜疏水结构域，结构域Ⅲ为功能保守的区域，有dicyclohexylcarbodimide（DCCD）结合位点，Glu-92在调节液泡H^＋-ATPase具有重要作用．该研究结果为克隆其全长基因和进一步研究其在薯蓣皂甙次生代谢生物合成中的功能提供了重要的实验基础．     

杨四瘿螨诱导的美洲黑杨抑制消减文库

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,以杨四瘿螨诱导48、72 h的美洲黑杨无性系为实验方(tester),以未经诱导的美洲黑杨无性系为驱动方(driver)构建杨四瘿螨诱导差异表达的抑制消减cDNA文库,共获得了710个克隆,所建cDNA文库的插入片段主要集中在200~1 000 bp之间。通过序列测定拼接和同源性对比分析,获得了美洲黑杨涉及信号传递、能量代谢、胁迫响应、物质运输等功能的差异基因。     

杨四瘿螨诱导的美洲黑杨抑制消减文库的构建及分析

采用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术,以杨四瘿螨诱导48、72h的美洲黑杨无性系为实验方（tester）,以未经诱导的美洲黑杨无性系为驱动方（driver）构建杨四瘿螨诱导差异表达的抑制消减cDNA文库,共获得了710个克隆,所建cDNA文库的插入片段主要集中在200～1000bp之间。通过序列测定拼接和同源性对比分析,获得了美洲黑杨涉及信号传递、能量代谢、胁迫响应、物质运输等功能的差异基因。     

一个与油菜黄化相关的未知功能基因克隆及表达

以构建的油菜幼叶黄化突变体Cr3529消减文库中一个未知功能的差异表达基因片段为基础,应用RACE-PCR技术,扩增并克隆到两个cDNA全序列,分别命名为BnCr4和Bn-Cr4-1.测序结果显示,BnCr4编码区序列大小为1395 bp,编码465个氨基酸,而BnCr4-1编码区序列长1311 bp,编码437个氨基酸.BLAST结果表明它们与拟南芥中的一个未知功能基因的cDNA同源性分别为87%和80%.功能预测显示它们含有与蛋白质的修饰作用有关的多个活性位点,如磷酸化、糖基化、酰胺化以及磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,可能是一种新的与cAMP介导的蛋白质磷酸化与去磷酸化作用有关的蛋白.Northen杂交结果显示该基因在Cr3529子叶期和幼叶期的表达高于野生型油菜,显示该基因的表达与突变性状紧密相关.最后,原核表达了BnCr4,得到了与预计分子量相同的融合蛋白.     

鸭跖草Commelina communis中差异表达cDNA 片段的克隆与分析

一种新的基因克隆技术称为抑制消减杂交技术(SSH)用于研究生长于2种生态环境(古铜矿山和正常土壤)中鸭跖草Commelina communis的基因表达差异.分别以Cu矿山鸭跖草作为检测子,非Cu矿山鸭跖草作为驱赶子,建立了生长于Cu矿山生态环境中鸭跖草的差异表达cDNA文库,此cDNA文库代表在Cu矿山鸭跖草中特异表达的cDNA.通过反式Northern杂交筛选出3个阳性克隆进行测序.序列分析表明其中一个cDNA为CaM-1ike基因.进一步对此基因进行Virtual Northern分析,结果初步表明此基因在生长于古铜矿山上的鸭跖草中上调表达.     

多重PCR技术分析日本对虾Marsupenaeus japonicus精巢和卵巢差异表达基因

通过多重PCR方法,对采用SSH(抑制消减杂交)技术制备日本对虾卵巢特异探针并筛选卵巢cDNA全长文库所获得的8个阳性克隆进行分析,研究这些新克隆的基因在精巢和卵巢的差异表达情况。这8个基因可分为二类,一类为卵巢特异表达的基因,一类为卵巢的表达量高于精巢的差异表达基因。     

钙离子敏感受体基因cDNA的克隆与序列分析

本研究通过RT-PCR技术从妊娠第九天的大鼠子宫中扩增出长为423bp的钙离子敏感受体cDNA片段,PC R产物经凝胶回收纯化后,克隆在PGEM-T载体的T位点.测序结果和序列分析表明,本试验已成功地扩增、克隆了钙离子敏感受体基因cDNA序列,为进一步研究钙离子敏感受体在大鼠子宫中的表达与调节奠定了基础.     

用差减cDNA文库筛选由热激导致的小鼠睾丸中差异表达的基因

采用抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization, SSH）方法,构建正常和热激小鼠睾丸组织的差减 cDNA 文库,以期 筛选出小鼠生精过程中对热敏感的基因。分别从正常和热激小鼠睾丸组织提取总RNA,反转录成cDNA,以正常小鼠睾丸组织cDNA作为待检组织(tester),以热激小鼠睾丸组织cDNA作为驱动组织(driver), 经过2轮杂交和抑制性PCR扩增,产物与T载体连接,经蓝白斑筛选,提取质粒,经EcoRI酶切鉴定插入片段并测序,由此构建了2种组织间差异表达基因的差减cDNA文库。用半定量RT-PCR方法,进一步验证 了该文库中差减出的基因基本上为差异表达的基因。对随机挑选其中的932个克隆测序,对有效测序的565个基因序列与GenBank数据库中发布的序列进行同源性比较,大部分片段都可以检索到同源序列。 结果显示,cPGES/p23等13个基因热激后表达量上调;septin2等120个基因热激后表达量下调。其中cPGES/p23为本研究中首次发现的小鼠生精过程中对热敏感的基因。     

大蕉冷诱导差减文库的构建与分析

以低温处理的大蕉幼苗cDNA为检测子,未处理的大蕉幼苗cDNA为驱赶子,利用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了大蕉幼苗冷诱导差减cDNA文库,通过点杂交差异筛选cD-NA文库,得到约50个低温下表达增强的候选克隆,对其进行DNA测序和同源性比较,发现获得的ESTs在功能上主要涉及信号传导、表达调控、非生物胁迫防御、蛋白质加工和能量代谢等方面。该SSH文库的构建为克隆大蕉抗寒相关基因奠定了基础。     

库拉索芦荟6号染色体表达序列标签的研究

将微分离的库拉索芦荟(Alove vera[L.] Burm.f)6号染色体DNA及库拉索芦荟叶总cDNA分别用LA-PCR(linker adaptor polymerase chain reaction)方法扩增,然后采用杂交片段扩增技术(hybrid specific amplification,HSA)分离6号染色体与cDNA同源的表达序列片段.对表达序列片段进行克隆,得到约40000个重组子.随机选取96个克隆进行分析,分别用DIG标记6号染色体的LA-PCR产物和cDNA扩增产物作探针对其进行点杂交,对显示阳性信号的克隆进行测序.将库拉索芦荟6号染色体的表达序列标签(expressed sequence tags, EST)与GenBank中核苷酸进行比较,发现库拉索芦荟6号染色体的表达序列中有87.4%与植物的EST具有同源性,12.6%的EST与人或动物的EST具有较弱同源性,其中与石刁柏的EST及非生物素胁迫下的小麦(Triticum aestivum)、咖啡(coffee)、高梁(Sorghum bicolor)和菠萝(pineapple)等作物的EST具有很高的同源性(＞93%).     

人乳铁蛋白基因克隆及表达载体构建

通过ＰＣＲ法扩增出２３６６bp的人乳铁蛋白cDNA、８００bp的山羊β－乳球蛋白基因５′端调控序列,经ＰＣＲ反应连接后,克隆到表达载体pLNCX中,测序结果表明,与ＧeneBank中登录的序列相比,所获人乳铁蛋白cDNA序列的同源性为９９．７４％,山头β－乳球蛋白基因５′端调控序列的同源性为９９．７５％。酶切结果证明得到了正确的重组载体,可用于乳腺生物反应器的研究。利用ＰＣＲ反应直接克隆目的片段,并通过同源序列进行ＰＣＲ连接,极大提高了克隆的速度和准确性,,为基因克隆及其表达研究带来了方便。     

眼斑芫菁在斑蝥素合成期的抑制性消减杂交文库构建及分析

斑蝥素是芫菁科昆虫合成的一种倍半萜类物质,对于治疗肿瘤和其他疾病有特别的疗效.通过构建抑制性消减杂交文库(SSH),筛选眼斑芫菁在斑蝥素合成期的差异表达基因.用斑点杂交对消减文库中的1 500个克隆进行筛查,130条特异表达序列标签(ESTs)进行分析.34条(26%) ESTs与NCBI中标注的假设基因有很高的同源性; 45条(35%) ESTs与NR数据库中的序列没有同源性,可能代表新的基因; 51条(39%) ESTs与已知基因的序列同源性很高,这些基因参与了生物调控、应激反应和解毒、信号转导、代谢与合成.最后通过实时定量逆转录PCR对文库中的9个上调表达基因进行验证.对眼斑芫菁在斑蝥素合成期的表达进行研究,为最终阐明斑蝥素的生物合成提供帮助.     

黄蜀葵查尔酮合成酶基因AmCHS克隆及序列分析

从黄蜀葵(Abelmoschus manihot) 花瓣中通过简并引物克隆得到查尔酮合成酶基因cDNA 核心序列,根据核心序列设计特异引物,再应用5′RACE 和3′RACE 技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得黄蜀葵查尔酮合成酶基因（AmCHS）cDNA全序列.序列分析结果表明AmCHS cDNA编码区长1170 bp,编码389个氨基酸。其氨基酸序列与其它已知高等植物CHS基因具有很高的同源性,并且包含了CHS 具有的活性位点和催化位点等保守性位点.     

黄蜀葵查尔酮合成酶基因AmCHS克隆及序列分析

从黄蜀葵(Abelmoschus manihot) 花瓣中通过简并引物克隆得到查尔酮合成酶基因cDNA 核心序列,根据核心序列设计特异引物,再应用5′RACE 和3′RACE 技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得黄蜀葵查尔酮合成酶基因（AmCHS）cDNA全序列.序列分析结果表明AmCHS cDNA编码区长1170 bp,编码389个氨基酸.其氨基酸序列与其它已知高等植物CHS基因具有很高的同源性,并且包含了CHS具有的活性位点和催化位点等保守性位点.