全细胞生物转化法制备γ-氨基丁酸

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA)是广泛存在于自然界的一种非蛋白质的功能性氨基酸.它是哺乳动物中枢神经中一种重要的抑制性神经递质.为了高效廉价制备GABA,采取谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)催化L-谷氨酸生成GABA的工艺.从K12来源的大肠杆菌(E. coli)基因组中PCR扩增得到GAD基因片段,并克隆到载体p ET-23a中,得到重组质粒p ET-23a-K12gad,并将其转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中,获得了能够重组表达GAD活性的工程菌株.从反应温度、p H、菌体量这三个方面对催化工艺进行了优化.为了进一步降低成本,通过化学法将谷氨酸钠转化为谷氨酸作为催化底物,提高转化速率的同时简化了纯化工艺.     

红腐乳中高产γ-氨基丁酸红曲霉菌株的筛选

从红腐乳中分离筛选到一株相对高产γ-氨基丁酸(GABA)的红曲霉菌株M-6,初步鉴定该菌株为紫红曲霉(Monascus purpureus).对菌株M-6的发酵培养基和发酵条件用单因素轮换试验和正交试验进行了整体优化.结果表明,菌株M-6转化富集GABA的适宜条件为:以可溶性淀粉为碳源、牛肉膏和硝酸钠为复合氮源,在初始pH5.0、培养温度40℃、摇床速度120 r/mim条件下发酵培养48 h,发酵液中GABA的产量最高可达7.826 g/L.表明利用红曲霉菌株进行富含GABA食品的生产是可行的.     

固定化谷氨酸脱羧酶转化γ-氨基丁酸的研究

研究卡拉胶制备固定化谷氨酸脱羧酶及转化γ-氨基丁酸(GABA)的最适条件.以本实验室研发的诱导剂对构建的表达谷氨酸脱羧酶(GAD)的基因工程菌进行诱导,并利用卡拉胶对获得的粗酶液进行包埋制备固定化酶,对影响GAD固定化效果和GABA产量的因素进行研究.最佳固定化条件为卡拉胶浓度1.5%,氯化钾浓度3%,硬化时间2 h;转化GABA的最适条件为反应最适pH为3.8～4.3,最适温度为37℃～43℃,将制得的固定化谷氨酸脱羧酶(IGAD)重复使用7次后,催化活力仍保持在最初值的75%;IGAD在最适底物浓度60 mmol/L下反应时间2 h后谷氨酸转化率达99%,利用IGAD进行连续催化反应,最终GABA摩尔转化率为70.98%,晶体得率为91.90%,晶体纯度94.73%.该法具有较好的操作稳定性和较高的底物转化率,为连续化制备γ-氨基丁酸提供参考.     

大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化

谷氨酸脱氢酶是生物体内最主要的氧化脱氨基酶类，为了进一步研究其功能，我们以大肠杆菌DH5α菌株基因组DNA为模板和相应的寡聚脱氧核苷酸为引物，进行PCR扩增大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因(NADP-specific glutamate dehydrogenase，gdhA gene)，将所得DNA片断连接到质粒pUC18上，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选和酶切鉴定，经测序证明序列正确无误后将gdhA基因连接到表达载体pTrcHisC上，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE和双波长扫描分析，确定大肠杆菌谷氨酸脱氢酶在大肠杆菌中表达时以包涵体的形式存在，未能检测到可溶性蛋白的表达，表达量可达菌体总蛋白的15％以上．     

耐酸乳酸菌的筛选及初步鉴定

以自然发酵泡菜汁液为菌源,以不同的pH值作为对照,并利用不同的pH值作为筛选的初步条件,对耐酸乳酸菌进行筛选,然后对筛选出的菌株做定性实验,包括:产生溶钙圈,革兰氏染色阳性,以及接触酶反应呈阴性.在本实验条件下初步筛选出耐酸性强的2株菌株:菌株2,菌株3,同时,对分离出的乳酸菌菌株划线于MRS固体斜面培养基上,于4℃下保存,为进一步研究奠定了良好的基础.     

定点突变内皮抑素Zn2+的结合位点及突变基因的克隆表达

从人胚肝组织中提取总RNA, 以逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法获得人内皮抑素编码序列, 采用定点突变技术将His2和His4双突变为Leu2和Val4. 将突变基因cDNA插入含有T7启动子的质粒pET-28b中构建表达质粒pMendo, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 筛选表达菌株BL21-Mute, 表达菌株经IPTG诱导后以包涵体方式产生大量内皮抑素突变蛋白. SDS-PAGE分析表明, 表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白质的30%. 复性、 纯化的内皮抑素突变蛋白纯度达到98%, 失去抑制人脐静脉内皮细胞增殖的活性.     

γ-氨基丁酸纯化的研究

γ-氨基丁酸(GABA)广泛分布于从哺乳动物到单细胞有机生物体,可以由谷氨酸脱羧酶转化L-谷氨酸或谷氨酸盐而成。γ-氨基丁酸分离、提取及与酶反应偶联体系建立进行研究,分离、提取方法能够提取高纯度产品。     

L-精氨酸产生菌的离子束诱变育种

采用N离子束对谷氨酸棒杆菌进行诱变处理,筛选磺胺胍抗性突变菌株,将突变菌株进行摇瓶发酵实验,选育出一株L-精氨酸产量较高和产酸性能比较稳定的突变菌株。该菌株L-精氨酸产量比出发菌株提高了24.8%。     

抗噬菌体产谷氨酸菌株的自然筛选

本文采用自然界直接分离法从不同来源土壤中筛选谷氨酸产生菌,经产酸测定、噬菌体抗性检查,筛选出25株抗噬菌体产谷氨酸菌株,其中有2株产酸率在3.0％以上。     

酸浆豆腐中产酸菌的耐高温紫外诱变

乳酸菌在食品及食品发酵行业具有广泛的应用,其中以乳酸菌发酵酸浆作为凝固剂的酸浆豆腐已逐渐成为人们关注的热点。酸浆豆腐发酵过程中以乳酸菌为优势菌,在酸浆豆腐点浆时,需在75℃以上高温下进行。普通乳酸菌无法耐受此温度且大量失活,影响产品的后熟。为了开发耐高温乳酸菌,以课题组从云南建水豆腐酸浆中分离的菌株为出发菌,通过紫外诱变的方式,温度梯度筛选获得4株耐高温产酸性能好的菌株。诱变获得4株菌均可在75℃耐高温30 min并保持较好的活性和产酸效果。研究所得突变菌株相比原始菌株均具有更好的耐热性和产酸性。其中HCUL 1.1801-1912Z活性最强、产酸能力最好,为4株菌中最优菌株,将该菌株用于发酵生产酸浆豆腐,将显著提高乳酸菌在豆腐中的活性和豆腐的品质。     

牦牛源产细菌素的乳酸菌的筛选鉴定

为筛选优良的产细菌素乳酸菌,用含0.5%碳酸钙的MRS固体培养基从19份牦牛粪便样本中分离出91株乳酸菌,进一步采用牛津杯法筛选产细菌素的乳酸菌,并结合16S rRNA序列扩增测序鉴定该批乳酸菌.结果表明:在排除有机酸、过氧化氢等抑菌因素后,从91株乳酸菌中筛选到9株对大肠杆菌ATCC25922和金葡球菌ATCC25923有明显抑制作用的乳酸菌菌株,该9株菌株对蛋白酶敏感,初步认定为产细菌素乳酸菌;经16S rRNA序列扩增测序鉴定该9株菌分别为海氏肠球菌,屎肠球菌,蒙氏肠球菌株和植物乳杆菌,其对常见抗生素不耐药,可作为益生菌的候选菌株.     

产共轭亚油酸乳酸菌的选育和鉴定

采用紫外分光光度法测定共轭亚油酸的含量,从13株实验室保存的乳酸菌中筛选出8株具有转化亚油酸生成共轭亚油酸能力的菌株.其中As1.2686产量最高,发酵液中共轭亚油酸含量达到13.63 mg/L;其次是菌株B11693,共轭亚油酸产量为11.55 mg/L.选择B11693做进一步的菌种鉴定,将传统的形态学、生理生化鉴定方法和细菌16SrDNA分子生物学鉴定方法相结合,鉴定菌株B11693为短乳杆菌.     

丙酸测定与丙酸高产菌的筛选、鉴定

采用表观筛选与丙酸HPLC测定方法,从富含丙酸菌与乳酸菌的奶酪中分离、筛选得到1株高产丙酸的菌株FS1026。对该菌株进行16S rDNA序列分析,构建相关序列进化树,鉴定该菌株为产酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici sp.)     

昆虫肠道共生菌中产γ-氨基丁酸菌株的筛选及鉴定

从白蚁、蜜蜂、蝗虫、蜻蜓等10种昆虫肠道中分离得到昆虫肠道共生菌51株,采用薄层色谱法初筛、高效液相色谱法复筛,获得了多株产γ-氨基丁酸(GABA)的菌株.对其中一株GABA产量较高的菌株FE-7进行了显微形态观察、生理生化与16S r DNA扩增序列系统发育分析,鉴定FE-7可能为芽孢杆菌属的一个新种,其发酵液中GABA含量初测为2.1 g/L以上.表明从昆虫肠道特境中筛选产γ-氨基丁酸菌株具有开发前景.     

γ-氨基丁酸经由细胞微丝骨架对拟南芥气孔开闭的负调控

为研究γ-氨基丁酸(GABA)信号在气孔开闭中的作用,将标记微丝的质粒35S-talin-GFP导入LBA4404农杆菌中,用浸花法转化哥伦比生态型(Columbia phenotype)拟南芥.通过卡那霉素抗性筛选,分别筛选到5个抗性株系.对T2代转基因幼苗根的荧光观察,证实了抗性株系均为转基因植株,在根的分生组织、伸长区、成熟区和气孔保卫细胞处都有较强的荧光表达.将GFP标记细胞骨架的转基因植株的叶片下表皮放在气孔张开液中充分反应2h,98%的气孔已经完全张开;将完全张开的气孔转移到含有1 mM GABA的溶液反应30 min,80%左右的气孔逐渐关闭,说明GABA信号是引起拟南芥气孔关闭的诱导因素,GABA能显著降低气孔开度,该信号促进气孔关闭是一个快速反应的过程.     

糖多孢红霉菌酮还原酶域在羰基还原中的应用

为研究糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域,催化羰基还原的底物特异性和立体选择性,PCR扩增了该酶域的编码基因(eryKR1),并将其克隆到表达载体pET-28a,得到重组质粒pET-eryKR1,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-eryKR1).将E.coli BL21(pET-eryKR1)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示E.coli BL21(pET-eryKR1)对环己酮的还原效果较好,产物环己醇的得率最高可达93.24%,而对其他3种底物几乎没有还原能力.利用E.coli BL21(pET-eryKR1)2催化2-甲基环己酮不对称还原,产物主要为顺式-2-甲基环己醇,产率可达41.87%,产物的对映体过量值为74.81%.     

益生乳酸菌的生理特性研究及其在发酵果蔬饮料中的应用

作为世界上最大的水果蔬菜生产国家之一,中国的水果蔬菜资源非常丰富,但其鲜销状况却不容乐观。此外,随着生活水平的提高和健康意识的增强,人们逐渐接受益生乳酸菌发酵技术开发的新型发酵果蔬饮料,这主导了果蔬饮料发展的方向。研究评价了不同种属乳酸菌的耐酸性和耐胆盐能力,得到5株能较好适应人体胃肠环境的菌株,并应用于复合果蔬汁的快速发酵。通过感官评定,确定了混合果蔬汁的优化比例。通过正交设计试验,优化发酵条件并进行单菌发酵和混合菌种发酵。实验结果表明,5株乳酸菌发酵产物的pH值均有大幅下降,酸度增加;发酵果蔬汁储藏第1周出现酸的转化;混合菌株发酵产品的酸度几乎是单一菌株发酵产品的2倍,酸的转化发生在冷藏第2周。     

利用ITS-RFLP标记辅助筛选白灵侧耳与杏鲍菇杂交菌株

为提高白灵侧耳菌株、杏鲍菇菌株及其杂交菌株筛选效率及鉴定的准确性,利用ITS-RFLP标记辅助单核杂交技术对白灵侧耳与杏鲍菇的杂交菌株进行了筛选.对5份白灵菇菌株和4份杏鲍菇菌株进行了种间配对杂交,根据亲本菌株交配型将其分成7个组合进行杂交.结果表明:9份亲本材料共具有6个A因子和7个B因子.利用该技术对杂交处理后的菌株样品进行筛选,获得了3份杂交菌株11D、53D、70D,其中杂交菌株11D与53D的菌丝生长速度与亲本菌株相比较差异显著;杂交菌株70D的菌丝生长速度与亲本菌株XB130DB相比较差异显著,而与亲本菌株BL130DB在菌丝生长速度上差异不显著.     

红曲菌转化子性状分析及分子验证

以根癌农杆菌（Agrobacterrium tumefaciens）介导的紫色红曲菌（Monascus purpureus）突变体库中的538株转化子菌株为材料,通过菌落形态观察并结合显微特征分析,筛选获得了9株形态特征变化显著的转化子,对其进行了分子验证和遗传稳定性检测,证明转化子基因组DNA中含有T-DNA插入片段,并能稳定遗传.在此基础上,采用乙醇提取法和改良的纸色谱法分别对转化子的主要代谢产物红曲色素和γ-氨基丁酸（γ-Ami-nobutyric Acid,GABA）进行了分析,发现突变株产生次级代谢产物的能力有不同程度的变化.     

植物乳杆菌Lactobacillu plantarumY1菌株胆盐水解酶基因(bsh)的克隆及重组表达

经同源蛋白比对分析设计引物,PCR 扩增获得植物乳杆菌Y1菌株bsh基因(975bp),首先克隆至表达载体pET-28a,转化E. coli BL21(DE3)菌株,IPTG 诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示表达的重组蛋白为包涵体.选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA 的E. coli Rosetta(DE3)作为宿主菌,仍旧没有改善表达产物的可溶性.但是,选择含IF2融合蛋白标签的pLS-IF2质粒构建表达载体,SDS-PAGE分析及Western blot 鉴定结果显示表达的融合重组蛋白IF2-BSH具有可溶性.该结果为进一步研究乳酸菌胆盐水解酶的生物活性,结构功能关系的研究奠定了基础.