拟南芥锌指结构域ABRv1基因的功能研究

为了分析拟南芥脱落酸响应蛋白RING-V1基因(ABRv1)的功能,构建了高表达载体pBI121-ABRv1,经农杆菌转化,花序浸染后得到T0代转基因种子,并经卡那霉素板筛选得到转基因苗,再经过两代的筛选获取了纯合的高表达株系ABRv1.通过DNA及RNA水平鉴定了ABRv1基因的T-DNA插入突变体abrv1.对突变体、高表达转基因株系及野生型进行ABA诱导处理,突变体的萌发率不足10%,野生型萌发率为40%,而过表达株系萌发率为67%;突变体株系气孔几乎全部关闭,过表达株系气孔关闭不明显,大小是突变体株系的2~3倍.结果表明ABRv1基因在拟南芥的ABA信号应答响应中可能起负调控作用.     

拟南芥RING finger结构域ABRv1基因的功能初步研究

拟南芥ABscisic acid responsive RING-v protein 1基因（ABRv1）编码一个含有RING finger结构域的E3连接酶。为了分析ABRv1的基因功能,我们首先构建了高表达载体pBI121- ABRv1,经农杆菌转化,花序浸染后得到T0代转基因种子,并经卡那霉素板筛选得到转基因苗,再经过两代的筛选获取了纯合的高表达株系ABRv1。通过DNA及RNA水平鉴定了该基因的T –DNA插入突变体abrv1。对突变体、高表达转基因株系及野生型进行ABA诱导处理,检测其萌发率、气孔关闭情况进行,发现ABA处理后突变体的萌发率降低,过表达株系萌发率升高;突变体株系气孔几乎未关闭,过表达株系气孔关闭非常明显。以上结果表明ABRv1基因在拟南芥的ABA信号应答响应中可能起负调控作用,为深入分析该基因的功能打下基础。     

AtVDAC2参与拟南芥盐胁迫信号应答过程

为了探索VDAC在盐胁迫信号传递途径中可能的传递关系,以AtVDAC2转基因拟南芥过量表达和抑制表达株系为材料,初步探索盐胁迫过程中该基因参与信号传递的方式.实验分析了NaCl处理对种子萌发的影响、Ca²⁺对NaCl胁迫下种子萌发的影响,以及NaCl对气孔运动的影响和盐胁迫相关基因的表达水平.实验结果指出,AtVDAC2基因表达水平变化影响了拟南芥对NaCl的敏感性:高表达的AtVDAC2使得拟南芥种子对NaCl敏感性提高,种子萌发率降低,气孔关闭较快;而低表达的AtVDAC2使得拟南芥对NaCl敏感性降低,种子萌发率高,气孔不易关闭.在NaCl胁迫下添加Ca²⁺,提高了敏感株系种子的萌发率,因而推测Ca²⁺帮助AtVDAC2转基因拟南芥过量表达株系平衡下游的胁迫应答.用实时荧光定量PCR检测盐胁迫应答相关基因SOS1,SOS2的表达水平,发现AtVDAC2的高表达引起了下游应答基因SOS1,SOS2表达水平的相应提高;相反AtVDAC2的抑制表达则导致SOS1,SOS2表达水平下降.由此说明,AtVDAC2参与了拟南芥盐胁迫应答过程.     

烟草内源细胞分裂素变化与植株形态发育的初步研究

农杆菌介导将异戊烯基转移酶基因(isopentenyl transferase,ipt)导入烟草SD株系的叶肉细胞,经过抗性筛选和鉴定,获得转基因植株.酶联免疫吸附(ELISA)测定叶片内源玉米素核苷(ZR)、异戊烯基腺苷(iPA)和吲哚乙酸(IAA)的质量分数.结果表明:转基因株系的ZR和iPA的质量分数w不同程度地升高,IAA水平随之升高.高水平细胞分裂素导致叶片的气孔密度增加、气孔长度和花型大小减小,以及花粉萌发率降低.当w(iPA+ZR)与w(IAA)的比值大于2时,成年植株上部侧枝茎端生长发育异常,出现丛生状小叶.本文讨论了细胞分裂素水平和细胞分裂素与生长素的比值对转基因烟草生长发育的影响.     

Fibrillin转基因油菜的再生及其光合特性的检测

用根癌农杆菌共培养法，以带有1～2 mm子叶柄的完整子叶为转化受体，将连有35S启动子和NPTⅡ标记基因的Fibrillin cDNA导入甘蓝型油菜主要栽培品种“2005南系”中，获得抗卡那霉素的转基因植株.对部分经卡那霉素筛选得到的再生植株进行PCR检测，有来自3个株系的植株表现为阳性，初步证实外源基因已整合到植物细胞基因组中.将转基因植株炼苗后移入大田，在3月初到4月末油菜开花结果期间，对叶片和角果进行光合指标和叶绿素荧光指标的检测以及产量性状分析，发现转基因植株和非转基因植株之间存在明显差异.     

AGO1基因对拟南芥叶边缘锯齿状发育的影响

在拟南芥和水稻中Argonaute(AGO)蛋白是RNA介导的沉默复合体(RISC)的核心组分,在植物叶极性的分化方面具有重要的调节作用。实验根据AGO1基因序列设计一对特异引物,提取野生型拟南芥RNA作为模板,采用反转录PCR方法扩增出AGO1基因,并插入到克隆载体pGEM-T中。筛选鉴定后将AGO1连接到植物表达载体pBI121上,构建起植物表达载体pBI121-AGO1。并且利用农杆菌介导的方法转化拟南芥,通过抗性筛选,获得转基因植株。然后对转基因植株进行表型分析及AGO1蛋白的RT-PCR检测。通过对转基因拟南芥表达分析发现,与野生型拟南芥相比超表达AGO1蛋白的转基因拟南芥叶片明显呈锯齿状,说明AGO1基因影响拟南芥叶片发育。     

转PSAG12-ipt基因结缕草的获得及其衰老特性分析

将拟南芥中衰老特异启动子PSAG12控制下的ipt基因导入结缕草胚性愈伤组织,经抗性筛选、PCR扩增和Southern杂交,共获得37株转ipt基因植株.其中有6个转基因株系衰老延缓,绿色期延长,生育后期其体内细胞分裂素、可溶性糖、可溶性蛋白等含量明显高于野生型,而脱落酸的含量明显下降.通过测定离体叶片培养过程中光合速率的变化,也证实了转基因植株叶片衰老速度明显减慢.其中T-1和T-12两个转基因株系能延长绿色期达25 d以上.     

转基因烟草的pap基因表达及其抗病毒生理的初步研究

农杆菌介导将美洲商陆抗病毒蛋白基因(pap)导入烟草云烟87品种的叶肉细胞,经过抗性筛选和鉴定,获得转基因植株.利用RT-半定量法分析了Y1、Y2和Y3转基因株系的pap表达,以及攻毒前后叶片多酚氧化酶(PPO)、超氧物歧化酶(SOD)活性和可溶性蛋白质含量.结果表明:pap在Y1和Y2植株中表达,Y3植株中未检测到pap表达;攻毒后,Y1和Y2叶片中可溶性蛋白质含量、PPO和SOD活性较高,而Y3叶片中可溶性蛋白质含量、PPO和SOD活性在三者中最低,与对照相似.讨论了转基因植株中pap表达与其生理变化和病毒抗性的关系.     

基于Gene-Deletor系统的安全复合性状转基因烟草研究

本研究利用农杆菌介导法将带有水稻花粉特异启动子籼稻花粉过敏原基因(OSIPA)启动子驱动的Gene-Deletor外源基因清除系统,水稻Os GA3ox2(D18)启动子驱动水稻Os GA2ox1基因,玉米Ubiquitin启动子驱动BAR::GUS融合基因为筛选标记基因以及水稻Actin1启动子驱动驱动抗虫Cry1Ab基因复合性状植物表达载体p GM626-D18-Os GA2ox1遗传转化三星烟草。通过GUS组织化学染色及PCR分子鉴定,获得了43株转基因烟草植株。结果表明,水稻OsGA2ox1基因在烟草中表达能降低转基因烟草植株高度,但不影响植株生殖生长。转基因烟草对烟草斜纹夜蛾幼虫具有抗性,可抑制烟草斜纹夜蛾幼虫的取食与发育。以50 mg/L的除草剂Basta处理野生型和转基因烟草离体叶片,发现BAR基因提高了烟草抗除草剂的能力。对12株转基因烟草T0代花粉外源基因清除效率进行研究,发现部分烟草株系外源基因清除可达到100%,其他未完全清除外源基因株系的清除效率介于42.84%~99.97%之间。     

转PSAG12-ipt基因结缕草的获得及其衰老特性分析

将拟南芥中衰老特异启动子PSAG12控制下的ipt基因导入结缕草胚性愈伤组织,经抗性筛选、PCR扩增和Southern杂交,共获得37株转ipt基因植株．其中有6个转基因株系衰老延缓,绿色期延长,生育后期其体内细胞分裂素、可溶性糖、可溶性蛋白等含量明显高于野生型,而脱落酸的含量明显下降．通过测定离体叶片培养过程中光合速率的变化,也证实了转基因植株叶片衰老速度明显减慢．其中T1和T12两个转基因株系能延长绿色期达25d以上.     

香根草转AtCBF3基因体系的建立及对其抗寒性的影响

温度是影响香根草在温、寒带推广应用的主要限制因子.为提高香根草的耐寒性,利用分子遗传学手段将拟南芥基因组中的转录激活因子基因AtCBF3导入香根草中,实现种质改良.本研究从野生型拟南芥哥伦比亚Columbia植株中克隆出AtCBF3,经酶切连接构建了表达载体pCAMBIA1301/AtCBF3.再通过农杆菌介导法导入外源基因后,在含抗生素培养基上筛选获得抗性植株,后经PCR和越冬试验后证实获得了抗寒性增强的转基因香根草植株.     

油菜突变体库构建与激素反应基因克隆分析

以优质高产的油菜品种1244W6为材料,采用浸花蕾方法,将含有激活标记和Basta筛选标记质粒pSKI015的农杆菌进行转化,成功构建了油菜激活标记突变体库.通过Basta筛选,结果共获得约30 000个转基因株系(T1代).将部分转基因株系种子(T2代)培养在不含任何激素、或含有不同浓度植物激素的营养液中,结果筛选出激素反应突变体63个,长下胚轴和短下胚轴突变体分别为15和13个.采用TAIL-PCR技术,克隆了W1016激素反应突变体T-DNA插入位点基因组旁邻序列.     

拟南芥AtPLC4基因RNAi载体的构建及遗传转化

利用RNAi技术,构建了AtPLC4基因的RNAi双元载体,并进行了拟南芥的遗传转化,通过抗性筛选及PCR鉴定,获得20株遗传转化株系.进一步通过RT-PCR检测,得到3株AtPLC4基因表达降低的转基因植株,为运用反向遗传学的方法深入研究AtPLC基因家族的生物学功能提供基础.     

拟南芥AtGluRS相互作用蛋白质VDAC及其转基因植物表型分析

电压依赖性阴离子通道蛋白质(voltage-dependent anion channel,VDAC)是拟南芥谷氨酰tRNA合成酶(AtGluRS)相互作用的蛋白质．为了研究VDAC蛋白的功能和作用,通过构建VDAC稳定表达载体,农杆菌介导的方法转化拟南芥,筛选和鉴定出VDAC过量和抑制表达植株．研究结果证实VDAC的过量和抑制表达植株影响气孔关闭和种子萌发．VDAC的过量表达导致植株对ABA敏感,VDAC的抑制表达降低了植株对ABA的敏感性．推测VDAC蛋白可能参与ABA信号途径．     

农杆菌介导的双价抗虫基因对番茄遗传转化的研究

采用农杆菌介导法将含有苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因(CryIAc)与半夏凝集素抗虫基因(Pta)的高效植物表达载体pCAMBIA3300转入番茄品系Micro Tom的子叶外植体中。经过共培养、除草剂筛选和分化再生,获得了24个具有除草剂抗性的株系。再将转化后的番茄植株经过PCR检测和Southern Blot检测,确定检测后呈阳性反应的株系为8个。通过小菜蛾幼虫初步抗性试验证明,转基因株系表现出较强的抗虫性。实验结果为进一步研究番茄抗虫性和培育抗虫番茄新品种奠定了重要基础。     

拟南芥At5g66070基因在ABA处理下的初步研究

本研究以拟南芥为实验材料,探索基因At5g66070在植物激素ABA处理条件下的相关生理功能.结果表明,在10μMABA处理下,该基因的表达量明显升高,表明该基因受到ABA的诱导.亚细胞定位发现AT5G66070定位在细胞核.通过DNA及RNA水平筛选鉴定At5g66070基因T-DNA插入纯合突变体,然后经根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得过表达转基因株系.表型分析发现经ABA处理后,突变体相对于野生型而言根长较短,表明突变体对ABA更为敏感.气孔关闭实验发现10μM ABA能诱导突变体气孔关闭,而野生型和过表达无显著影响.以上结果表明At5g66070在拟南芥的ABA胁迫响应中起负调控作用.     

过表达内质网小分子热激蛋白提高拟南芥的衣霉素抗性

内质网小分子热激蛋白是热激蛋白家族成员,具有分子伴侣活性.当植物受到内质网胁迫(ER-stress)时,内质网小分子热激蛋白具有缓解内质网胁迫的功能.我们将CaMV35S启动子驱动的内质网小分子热激蛋白基因AtHSP22.0导入拟南芥,Northern-blotting印迹分析表明,内质网小分子热激蛋白在转基因拟南芥中呈现组成型表达.转基因株系衣霉素抗性强于对照,说明AtHSP22.0的过量表达增强了拟南芥的衣霉素抗性,缓解了ER-stress.     

根癌农杆菌介导的绿色荧光蛋白基因在水稻植株中的表达

将改良的绿色荧光蛋白（EGFP）基因插入到植物表达载体中,构建了ubi启动子驱动下的植物表达载体p13UEGFP．通过根癌农杆菌介导转化水稻的胚性愈伤组织,经潮霉素筛选,获得抗性愈伤组织和再生植株．对T2代植株进行PCR分析、激光共聚焦显微镜检测和RT—PCR分析,结果表明,绿色荧光蛋白基因已经在转基因植株中稳定表达．     

拟南芥谷氨酰tRNA合成酶同其相互作用蛋白VDAC的转录水平分析

本研究在基于前期对拟南芥VDAC（电压依赖性阴离子通道蛋白质）与AtGluRS（谷氨酰tRNA合成酶）两种基因的过量表达和抑制表达转基因突变体株系的初步生理性状分析基础上,对筛选获得的转基因T1代植株以及拟南芥abi1、abi2突变株,进行转录水平两种蛋白特异性基因片段的地高辛标记Northern杂交以及半定量RTPCR分析.结果显示,在拟南芥abi1、abi2突变株中,VDAC和AtGluRS两种基因的转录表达均收到不同程度的抑制;而VDAC与AtGluRS两种基因之间存在间接或直接的正调控关系,进一     

H2O2介导的NO合成参与乙烯诱导的拟南芥叶片气孔关闭

利用药理学实验、激光共聚焦显微技术结合遗传学手段,证明光下乙烯利可诱导拟南芥叶片气孔关闭,且具有时间和剂量效应. 乙烯利能够明显增加气孔保卫细胞和叶片的H2O2和NO水平,且H2O2和NO清除剂均明显抑制乙烯利诱导的拟南芥叶片气孔关闭.硝酸还原酶(NR)、NADPH氧化酶和细胞壁过氧化物酶的抑制剂可不同程度抑制乙烯利的作用. 乙烯利亦可明显诱导Atnoal突变体叶片气孔关闭及NO的积累,但对nial,nia2突变体没有明显影响.清除H2O2可减弱乙烯利对NO含量和NR活性的诱导效应,说明H2O2和NO均参与乙烯诱导的拟南芥叶片气孔关闭,且NO(主要由NR途径合成)可能位于H2O2下游参与调控这一信号通路.