组织工程人角膜内皮在维持新西兰兔角膜透明中的效果研究

为了评价组织工程人角膜内皮(TE-HCE)维持动物角膜透明的效果,利用来自非转染人角膜内皮(HCE)细胞系的核型正常单克隆细胞株为种子细胞、以去上皮层修饰羊膜为载体支架体外重建的TE-HCE,对新西兰兔进行了穿透性角膜内皮移植试验,利用肉眼观察了移植兔眼的水肿和免疫排斥情况,利用裂隙灯显微镜检测了移植兔角膜的透明情况,并利用荧光显微镜检测了移植兔角膜内皮细胞的CM-DiI标记。对撕除后板层新西兰兔眼进行TE-HCE穿透性角膜内皮移植实验的观察和检测结果显示,移植后的兔眼角膜没有出现明显的水肿和排斥等不良反应,使移植兔角膜维持透明的时间长达100d,且角膜内皮移植区的细胞均为带有CM-DiI标记、来自TE-HCE的种子细胞。由此可见,体外重建TE-HCE移植后能使新西兰兔角膜长期保持透明,有望作为HCE的替代物用于角膜内皮失代偿和角膜内皮盲的临床移植和治疗。     

体外培养人角膜内皮细胞的UVB损伤及抗坏血酸的抗氧化保护作用研究

以非转染人角膜内皮(HCE)细胞系为体外实验模型系统研究了UVB氧化损伤、Asc抗氧化保护及其分子机理。体外培养的HCE细胞经UVB和/或Asc处理后,利用MTT和光镜对细胞的活力和形态进行了检测,利用8-羟基脱氧鸟苷免疫荧光染色对DNA的氧化损伤进行了检测,并利用二氢乙啶染色对胞内活性氧(ROS)的水平进行了检测。结果显示,100~800 mj/cm²的UVB辐射能剂量和时间依赖性地损伤HCE细胞的活力;200 mj/cm² UVB(自然太阳光中的平均辐射剂量)能引起HCE细胞发生皱缩,并显著增加细胞的DNA氧化损伤程度及胞内ROS水平;而1 mmol/L Asc不仅能显著增强HCE细胞的活力、促进细胞分裂,而且还能显著降低200 mj/cm² UVB所引起的DNA氧化损伤及胞内ROS水平。综上所述,UVB通过诱导ROS的产生进而引起DNA氧化损伤,对HCE细胞具有显著的氧化损伤作用;而Asc能够通过降低UVB诱导的ROS水平进而保护DNA免受氧化损伤,对HCE细胞的UVB损伤具有一定的抗氧化保护作用。本文研究结果对于利用Asc等抗氧化保护剂保护HCE细胞免受UVB氧化损伤具有一定的理论指导价值。     

端粒酶转染防治角膜内皮失代偿的研究

目的评价端粒酶转染对角膜内皮细胞形态和功能的影响。方法将体外培养的猫角膜内皮细胞随机分为3组,兔端粒酶基因转染组、正常对照组和表皮生长因子组。培养30代后观察传代细胞形态和细胞周期各时相细胞比例的变化,检测端粒酶逆转录酶蛋白和Ⅳ型胶原的表达。结果兔端粒酶基因转染组细胞数目较正常对照组和表皮生长因子组增多,伸展贴壁能力增强,表型正常,G2～M期和S期细胞比例显著增加,端粒酶逆转录酶蛋白和Ⅳ型胶原的表达也较正常对照组增多。结论兔端粒酶转染可以促进猫角膜内皮细胞增殖且表型正常,可以增强其伸展粘附能力和分泌功能,有利于防治角膜内皮失代偿。     

人角膜细胞在体外培养的研究进展

人角膜是光通过的窗口，在维持眼压和对光路调节方面也起着重要的作用，由角膜缺损或病变引起的眼疾严重时会导致患者失明。目前治疗这类疾病的唯一办法就是角膜移植，但是及其匮乏的角膜供体使得多数患者失去重新获得光明的机会。近些年来兴起的组织工程人角膜体外重建技术给数以千万计的患者带来了福音。来自自体的人角膜细胞是上述组织工程所需的最理想的种子细胞，本文就人角膜细胞在体外的培养和扩增的进展和存在的问题进行综述。     

组织工程人角膜内皮的研究进展

从种子细胞的来源和载体支架的制备两个方面对组织工程人角膜内皮的研究进展及其前景进行综述。     

兔和牛角膜上皮、基质及内皮细胞体外培养和增殖的研究

目的：研究兔和牛角膜上皮、基质及内皮细胞等3种细胞体外培养的生物学特性，探索和改进这3种细胞体外培养的方法，为组织工程角膜奠定基础。方法：采用消化法分离培养兔和牛角膜上皮、内皮和基质细胞，观察细胞贴壁生长情况，同时对生长良好的原代细胞进行消化传代，进一步观察传代细胞的形态和生长情况。结果：角膜上皮、内皮和基质细胞均在培养48～72h贴壁生长，培养6～9d能形成良好单层，细胞形态典型，进行多次传代后细胞仍维持原有形态和功能，获得的细胞能进行长期培养。结论：为兔和牛角膜上皮、内皮和基质细胞体外培养，提供了简单高效经济的方法。     

角膜内皮体外模型玻璃化法保存研究

以牛角膜内皮细胞在培养至融合时的单层细胞作为角膜内皮的体外模型,采用两种玻璃化溶液,考察玻璃化过程对细胞活性的影响.首先以光学显微镜和扫描电镜考察了体外模型的细胞形态和胞间连接情况,发现培养的角膜内皮细胞融合后无论是细胞形态和胞间连接都与天然的角膜内皮相近.然后用低温显微镜考察了两种玻璃化溶液在升降温过程的结冰情况,发现两玻璃化溶液在100 ℃/min的降温和升温速率下都能玻璃化且反玻璃化较弱.设计了一套保护剂的导入和洗脱方案,使得内皮细胞的体积变化维持在-50%～40%.最后以CCK-8试剂盒考察了玻璃化溶液的毒性和细胞经冷冻后的活性,发现VS2的毒性比VS1强;经VS1和 VS2冷冻后的细胞活率分别为61.3%和51.7%,这说明VS1的保存效果比VS2好.     

人肝癌细胞系HepG2生物学特性分析

人肝癌细胞系HepG2是进行抗癌药物检测及肝细胞生理性状研究的重要细胞系.充分了解该细胞系的生长增殖和遗传特性,对于细胞系的应用具有重要意义.本研究对体外连续传代培养的HepG2细胞,进行了生长曲线、分裂指数、染色体核型等生物学特性分析.结果表明:HepG2细胞在体外培养条件下,生长曲线呈典型的S形,群体倍增时间为24 h;分裂指数最高达4.5%;染色体数目为41～114,染色体众数为54～69(80%).     

反义人端粒酶催化亚单位基因转染对人结肠癌细胞恶性表型的逆转作用

利用基因重组技术,人端粒酶催化亚单位基因反向插入真核表达载体pcDNA3.0,获得重组体pcDRTRT,通过脂质体法导入人结肠癌细胞株SW-111C,获得稳定转染细胞系,即反义细胞.该细胞易脱落,出现明显生长抑制现象;失去叠落生长能力;流式细胞仪(FCM)证实导入反义hTRT后,G0/1期细胞增加,G2M和S期细胞减少,增殖指数(PI)降低;且不能在软琼脂中形成集落.说明反义hTRT基因体外导入结肠癌细胞株SW-111C可以明显降低端粒酶活性,抑制结肠癌细胞的增殖且能使其恶性表型发生逆转.     

贝特舒对人角膜上皮细胞凋亡诱导作用的实验研究

为了揭示常用青光眼药物贝特舒(betaxolol)对人角膜上皮(HCEP)细胞的毒性及其作用机理,使用不同质量浓度贝特舒对体外培养HCEP细胞进行了处理,并利用倒置显微镜跟踪观察了细胞的生长和形态,用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染色法检测了质膜的通透性,用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的断片化,用透射电镜检测细胞的超微结构。发现在0.17500~2.80000g/L的质量浓度范围内,贝特舒对HCEP细胞具有显著的毒性,并随着质量浓度的提高和处理时间的延长而逐渐增大,处理24h即可使大部分细胞皱缩死亡;进一步的研究结果发现,质量浓度为0.17500~2.80000g/L的贝特舒能显著提高HCEP细胞的质膜通透性,并使其出现DNA断片化、染色质凝缩和形成凋亡小体等凋亡细胞的结构变化。可见,在贝特舒0.17500~2.80000g/L的质量浓度范围内对HCEP细胞具有显著的毒性,并具有质量浓度和时间依赖性,其毒性作用的发挥是通过诱导细胞凋亡实现的,在眼科临床应用中毒副作用极大。     

A study of chitosan blend film as a carrier of corneal endothelial cells

In order to evaluate the cytocompatibility and biocompatibility of a new kind of chitosan blend film as a carrier of corneal endothelial cell, rabbit corneal endothelial cells cultured in vitro were breeded onto the film. After a cell monolayer formed, the scanning electron micrography was performed. After inplanted into anterior chamber, slit lamp observation, thickness metering, specular microscopy and HE staining were performed at random time after operation to evaluate the biocompatibility. Inflammation in anterior, thickness of cornea, cell density, hexagonality and cell size of the surgical cornea were taken as the indexes of biocompatibility. The cultured cells exhibited a confluent monolayer 10 days after incubation, which proved the satisfactory cytocompatibility of this film. Biocompatibility assay results suggested the implantation feasibility of the film as a carrier of corneal endothelial cells.     

利多卡因对人角膜上皮细胞的毒性作用及其机理研究

利用不同浓度利多卡因（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）处理体外培养的人角膜上皮（ＨＣＥＰ）细胞系细胞,利用光镜观察、ＭＴＴ、荧光染色、ＤＮＡ电泳、ＴＵＮＥＬ、流式细胞仪和透射电镜方法研究了利多卡因对 ＨＣＥＰ细胞的毒性作用及其机理。光镜观察和 ＭＴＴ检测结果显示,质量浓度 １２５～１０００ｇ／Ｌ的利多卡因对 ＨＣＥＰ细胞具有显著的毒性作用,并具有浓度和时间依赖性;ＡＯ／ＥＢ荧光双染色结果显示,质量浓度 ０６２５～１００００ｇ／Ｌ的利多卡因可引起 ＨＣＥＰ细胞的质膜通透性显著提高,细胞凋亡率也具有浓度和时间依赖性;ＤＮＡ电泳和 ＴＵＮＥＬ检测结果显示,利多卡因能引起 ＨＣＥＰ细胞发生 ＤＮＡ断片化;ＴＥＭ观察结果显示,利多卡因能引起 ＨＣＥＰ细胞的超微结构出现了凋亡细胞的形态结构特征,如胞质空泡化、染色质浓缩、线粒体膨胀且嵴的结构紊乱、出现凋亡小体等;ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ染色的流式细胞仪检测结果显示,利多卡因能引起 ＨＣＥＰ细胞质膜中的磷脂酰丝氨酸（ＰＳ）发生外翻变化;ＥＬＩＳＡ检测结果显示,利多卡因还能引起 ＨＣＥＰ细胞中胱冬肽酶3、8、9、10表达量的增加,表明利多卡因确能引起 ＨＣＥＰ细胞发生细胞凋亡,而不是细胞坏死。由此可见,利多卡因在质量浓度大于 0.625ｇ／Ｌ时对 ＨＣＥＰ细胞具有显著的细胞毒性,并具有浓度和时间依赖性,且其毒性作用的发挥是通过诱导细胞凋亡实现的,在眼科临床应用中具有很大的毒副作用,应谨慎使用。     

性激素是HPV16—DNA永生化人外宫颈上皮细胞的弱调节剂

研究激素对ＨＰＶ１６－ＤＮＡ永生化人外宫颈上皮细胞（ＨＣＥ１６／３细胞系）体外生长的影响。方法：使用［３Ｈ］－胸苷掺入试验,软琼脂糖集落试验和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹法分析了性激素对ＨＣＥ１６／３细胞的生长调节和病毒基因的表达。结果：在无类固醇血清无酚红的培养条件下,雌二醇和孕酮对ＨＣＥ１６／３细胞的生长无明显影响,而胰岛素则是ＨＣＥ１６／３细胞的生长刺激素。胰岛素的刺激细胞生长作用不能被性激素所增强;雌二醇也不能诱导ＨＣＥ１６／３细胞停泊独立生长。但Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析显示性激素上调ＨＣＥ１６／３细胞病毒早期基因表达,该基因的表达可能与ＨＰＶＤＮＡ永生化细胞的生长有关。结论：ＨＣＥ１６／３细胞的生长仍然依赖于生长因子,性激素刺激病毒早期基因表达,要阐明性激素对人宫颈癌发生所起的作用,仍需做更多的工作     

Induction of corneal epithelial prosenitors from bone-marrow mesenchymal stem cells of rhesus monkeys in vitro

Bioengineered corneas are substitutes for human donor tissue that are designed to treat severe disease affecting ocular surfaces. However, a shortage of candidate seed cells for bioengineering corneas is still a problem. Bone-marrow mesenchymal stem cells （MSCs） are capable of multilineage differentiation. Therefore, we determined whether MSCs differentiate into corneal epithelial cells （ECs）. We applied three exoteric-microenvironmental systems to induce MSCs to become ECs. Induced MSC were identified by means of morphologic examination, immunocytochemical analysis, and flow cytometry. MSCs grown in one microenvironment had characteristics similar to those of corneal epithelial progenitors. Induced MSCs expressed markers for EC, including integrin 61, Cx43, Pax6, and P63. MSCs were successfully induced to become corneal epithelial progenitors. Therefore, the use of MSCs may hold substantial promise for reconstructing the ocular surface after corneal injury.[第一段]     

OA对人肝细胞HL-7702和肝癌细胞Bel-7402增殖的影响和对细胞凋亡的诱导作用研究

 以人肝细胞HL-7702和肝癌细胞Bel-7402为研究对象,通过MTT法、细胞外部形态观察、Annexin V.FITC&;PI双染法及TUNEL法等方法,研究了腹泻性贝毒的主要组分大田软海绵酸（Okadaic acid, OA）对其增殖的影响及对细胞凋亡的诱导作用。结果表明：OA对人两株细胞的增殖均有显著的抑制作用,24 h IC₅₀分别为65 ng/mL和60 ng/mL,且这种抑制作用呈剂量依赖性。OA导致两株细胞的形态均发生明显变化：细胞变圆,脱壁,细胞膜形成泡状突起,最终形成膜包裹的凋亡小体。Annexin V.FITC和PI双染法及TUNEL法检测均发现：OA能够诱导两株细胞发生不同程度的凋亡,且凋亡细胞的比例与OA的浓度相关。以上结果表明：OA能够通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡而对人肝细胞和肝癌细胞造成影响,且这种影响的程度与OA的浓度和作用时间密切相关。     

角膜力学生物学研究进展

 作为眼屈光系统的重要组成部分，角膜组织在眼内压的作用下，受到复杂载荷作用，角膜细胞能够感受力学刺激并做出积极响应。本文通过分析角膜组织的受力情况，综述了力学刺激下角膜细胞的生物学响应及其与角膜损伤修复和相关眼疾患之间的关系。