基于Cre/Loxp系统的Ankle2 基因敲除鼠模型的建立

建立Ankle2基因敲除小鼠模型,为研究该基因在小鼠体内所发挥的重要生理功能提供基础. 本实验利用条件性基因敲除技术,进行打靶载体的设计与构建.将LoxP1st插入到Ankle2基因的第二内含子里,在第五内含子里插入FRT-neo-FRT-LoxP 元件,利用限制性内切酶DNA 及Southern blot 筛选出中靶ES 细胞克隆,随后将发生同源重组的ES细胞注射进C57BL/6J小鼠囊胚中,移入受体小鼠子宫,将得到的嵌合体雄鼠与C57BL/6J雌鼠交配获得Ankle2-Floxed 小鼠. 随后将Ankle2-Floxed 小鼠与全身表达FLP 酶的小鼠进行杂交,将打靶载体中的Neo基因去除,获得F1 代小鼠,F1 代小鼠自交并经PCR 鉴定筛选出Ankle2flox/flox小鼠.Ankle2flox/flox小鼠与全身或组织特异性表达Cre酶小鼠进行杂交,得到Ankle2基因杂合敲出小鼠,该小鼠自交,可获得Ankle2基因纯合敲除的小鼠模型. 该模型为深入研究Ankle2 基因在胚胎发育和衰老发生等中的调控功能提供材料和思路.     

国内期刊亮点

正构建黏蛋白1基因敲除小鼠模型黏蛋白1(MUC1)属黏蛋白家族成员,分布于上皮细胞膜表面,由于在免疫炎症反应以及肿瘤发生中的重要作用而日益受到重视。上海交通大学程布凯等为了进一步深入研究MUC1的生物学功能,构建了Muc1基因敲除小鼠模型。研究人员首先根据小鼠Muc1基因组序列设计基因剔除策略,将2个loxP位点分别插在外显子2和3两侧,构建基因剔除载体Muc1-ABRLFnpBR322。以电穿孔方法将载体导入胚胎干细胞(ES细胞),用G418和更昔洛韦进行正负筛选获得4个同源重组的ES细胞克隆。挑选其中一个阳性ES克隆行囊胚显微注射,获得16只嵌合率大于50%的雄鼠;其次,利用嵌合雄鼠与C57BL/6J野生型雌鼠交配后获得11只floxP杂合子小鼠(10雄1雌),通过杂合子小鼠回交,并进一步与EIIa-Cre小鼠交配,最终成功得到Muc1全身敲除小鼠,其中纯合子小鼠未     

LIM结构域蛋白KyoT基因剔除小鼠的建立和表型分析

KyoT为一LIM结构域蛋白,可与转录因子RBP-Jk相互作用而调节其转录活性.构建了KyoT基因剔除载体,转染小鼠胚胎干细胞(ES细胞)后得到同源重组的ES细胞克隆.将此ES细胞注射入小鼠的囊胚泡得到嵌合小鼠,再经小鼠培育得到KyoT基因被剔除的小鼠.纯合子KyoT基因剔除小鼠不能表达有功能的KyoT蛋白.表型分析表明纯合子KyoT基因剔除小鼠腹腔B1B细胞数增加,提示KyoT可能参与B淋巴细胞的发育.     

Pumilio1/Pumilio2双基因条件性敲除小鼠模型的建立及基因型鉴定

目的建立及鉴定Pumilio1/Pumilio2(Pum1和Pum2)双基因条件性敲除的小鼠模型,为进一步研究PUF家族在哺乳动物精子发生中的生物学功能奠定基础。方法将构建的Pum1条件性敲除和Pum2条件性敲除的两个品系小鼠进行交配并繁殖,最终繁殖成功的子代小仔Pum1和Pum2两个基因均为纯合子。对子代以剪趾方式进行编号,提取子代小鼠脚趾或鼠尾基因组DNA,用PCR法和琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型。结果 Pum1和Pum2双基因条件性敲除的小鼠模型繁殖成功,同时获得更多PUF家族双基因条件性敲除的小鼠。结论成功建立了Pum1和Pum2双基因条件性敲除的小鼠模型;正确的交配繁殖策略和鉴定方法是获得PUF家族双基因条件性敲除小鼠的有效途径。     

用精原干细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的实验研究

目的　探讨精原干细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的可行性 .方法　构建乙肝病毒X基因表达载体 pcDNA3 X ;应用微量注射针将脂质体包裹的 pcDNA3 X表达载体直接注入C5 7BL/ 6N雄性小鼠睾丸的曲细精管内 ,于第一次注射后 6周 ,与雌鼠交配 ,用PCR法和免疫组化法检测仔鼠基因组中的外源DNA和肝组织中表达的 pX蛋白 .结果　共产仔鼠 16只 ,其中 1只为阳性仔鼠 ,阳性率为 6 .2 5 %.结论　初步明用精原干细胞介导法制备X基因转基因小鼠是可行的 .     

胎肝Sca-1+细胞移植造血重建

目的:观察胚胎肝Sca-1+细胞能否重建造血。方法:免疫磁珠法分离孕14 5dC57BL/6J小鼠的雄性胚胎肝的Sac-1+细胞,经尾静脉注射(细胞数为2 0×103/只)移植到致死剂量(10 0Gy)放射线照射的8～10周C57BL/6J雌性小鼠;sry基因PCR方法检测受体小鼠外周血中供体来源的血细胞。结果:移植胚胎肝Sca-1+细胞的实验组小鼠外周血各种血细胞数在5d后开始下降,在10d后开始上升,20d恢复至正常,均存活6个月以上;而未移植Sca-1+造血干细胞的对照组小鼠20d内全部死亡。多聚酶链式反应(PCR)显示实验组小鼠外周血细胞sry基因检测阳性,未移植对照组小鼠外周血细胞sry基因检测均为阴性;随着移植时间的延长,移植小鼠外周血细胞sry基因的PCR扩增物量增加,说明雄性胚胎供体来源的细胞在增加,反映造血重建情况。结论:胚胎肝Sca-1+细胞能重建致死剂量放射线照射的小鼠造血功能。     

小鼠囊胚的不同遗传背景对形成ES细胞集落的影响

使用正常囊胚经过内细胞团增殖后的离散程序，比较了小鼠C57BL／6品系、129品系和C57BL／6与129杂交的囊胚在形成胚胎干细胞（ES细胞）集落上的差异。C57BL／6品系的正常囊胚经培养后只有17．4％的胚胎出现ES集落，细胞生长迅速但极易分化。129品系为41．0％，细胞生长比较缓慢。而杂交鼠胚易于出现ES细胞集落，高达75．0％，有利于ES细胞系的建立。文中讨论了在嵌合体工作中使用这种杂交鼠胚ES细胞的可能性。     

血红素加氧酶-1 基因敲除小鼠的饲养和鉴定

摘要: 目的 繁殖并鉴定 HO-1 基因敲除( HO-1 － / － ) 小鼠。方法 将引进的 HO-1 基因敲除杂合子小鼠,进行 SPF 级饲养,与 C57BL/6 野生型小鼠配种繁殖,提取子代小鼠的基因组 DNA,PCＲ 法特异性扩增 HO-1 基因片段,使用 双脱氧测序法测得基因序列。子代小鼠出现 3 种基因型: 野生型、杂合子型及纯合子型。杂合子小鼠进一步配种 繁殖,以获得更多的基因敲除纯合子小鼠,纯合子小鼠用以课题研究。结果 HO-1 基因敲除杂合子小鼠的饲养和 繁殖均获得成功,获得了 HO-1 基因敲除纯合子和杂合子小鼠。结论 正确的饲养繁殖及鉴定方法是从 HO-1 基因 敲除杂合子小鼠中获得纯合子小鼠的有效途径。     

C57BL/6J胚胎冷冻小鼠的遗传监测和分析研究

目的用生化标记和微卫星检测法观察近交系C57BL/6J小鼠胚胎冷冻后的遗传质量是否发生改变。方法采用国标(GB/T 14927.1-2008)生化标记基因检测法对4只玻璃化冷冻、解冻移植后获得的C57BL/6J F1代小鼠的13个生化位点进行预检测,再根据微卫星DNA多态性的遗传监测方法进行多态性分析。结果4只玻璃化冷冻后移植获得的C57BL/6 F1代小鼠的遗传概貌与国标(GB/T 14927.1-2008)中的14个生化位点完全一致;并与本文作者已建立"几种常用近交系小鼠微卫星DNA多态性的分析研究"的遗传监测结果完全相符。结论玻璃化冷冻法(EFS40,straw)对C57BL/6J冷冻胚胎小鼠的遗传物质并未造成影响,其遗传特性保持稳定,是可行的小鼠胚胎冷冻方法。     

用大鼠心肌条件培养基建立来源于C57BL/6J小鼠的ES细胞系

报道一种新的建立C57BL/6J小鼠ES细胞系的方法。采用大鼠心肌条件培养基,在不使用饲养层细胞和白血病抑制因子(LIF)的情况下,从C57BL/6J品系小鼠中建成1个ES细胞系即MESPU 41,成系率为1.0%。MESPU 41细胞为XX型,核型正常率高达89%,表现出XX型ES细胞系少有的稳定性。进行体内分化实验时MESPU 41细胞能发生广泛分化形成畸胎瘤。嵌合体制作实验证实MESPU 41细胞具有嵌合能力,能参与胚胎的发育。采用RT-PCR方法,检测出大鼠心肌细胞有LIF mRNA的表达,这可能与其条件培养基保持ES细胞未分化状态并使X染色体稳定有关。同时,还对大鼠心肌细胞进行了永生化的尝试,共得到了4个永生化克隆,这将进一步简化ES细胞建系和培养工作,为进一步研究ES细胞在体外培养过程中的稳定性开创了新的起点。     

遗传工程小鼠冻存卵巢异体原位移植比较研究

目的 对 C57BL / 6 J 为背景的遗传工程小鼠卵巢冷冻及复苏后原位移植进行研究,建立遗传工程小鼠卵巢 冷冻方法,弥补小鼠资源保种体系。 方法 采用 DAP213 方法冷冻保存了 C57BL / 6 J 及 SCARB2、PSGL1、IGB3S 三 个遗传工程小鼠 10 日龄幼鼠的卵巢,将四个品系 10 日龄幼鼠的新鲜卵巢及冻存复苏卵巢原位移植到 4 周龄 C57BL / 6 J 及 C57BL / 6 J( Cg) —Tyrc- 2 J / J( B6 albino)受体雌鼠,术后饲养 5 周与 10 周龄性成熟 C57BL / 6 J 雄鼠交 配,观察移植出生幼仔。 结果 C57BL / 6 J 新鲜卵巢和冻存卵巢,三个品系遗传工程小鼠的冻存卵巢原位移植到 C57BL / 6 J 和 B6 albino 受体中,均可以恢复正常功能,交配后得到仔鼠。 结论 采用 DAP213 方法冻存 C57BL / 6 J 及以 C57BL / 6 J 为背景的遗传工程小鼠卵巢,复苏后原位移植到 C57BL / 6 J 和 B6 albino,交配后产仔,卵巢冻存方 式是小鼠资源库保存的一个重要补充。     

PAX-8基因敲除小鼠的饲养繁殖及基因型鉴定

目的繁殖和鉴定PAX-8基因敲除小鼠。方法将引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型,提取每种基因型小鼠尾部基因组DNA,用PCR法进行鉴定,将其雄性杂合子与雌性杂合子交配,依照孟德尔遗传定律就有可能获得较多的基因敲除纯合子小鼠。结果PAX-8杂合子小鼠的繁殖和饲养均获得成功,亦获得了较多的基因敲除纯合子小鼠。结论正确的饲养繁殖以及鉴定方法是从杂合子中获得PAX-8基因敲除纯合子小鼠的有效途径。     

小鼠早期胚胎不同移植方法的建立

目的建立小鼠胚胎移植技术,探索小鼠胚胎输卵管伞部移植、输卵管剪口移植和子宫移植技术要点,为进一步将该项技术应用到生物净化等领域提供参考数据。方法对4周龄C57BL/6雌性小鼠采用腹腔注射7.5 IUPMSG(孕马血清促性腺激素),48 h后腹腔注射7.5 IU HCG(人绒毛膜促性腺激素)进行超数排卵处理,并与C57BL/6雄鼠合笼,分别在见栓0.5 d、1.5 d和3.5 d取出相应胚胎,对所得胚胎进行筛选,将质量较好的胚胎选出,并将相应胚胎阶段(单细胞、2细胞、囊胚)移入同期发情并经KM结扎雄鼠交配刺激后见栓的KM假孕小鼠输卵管或子宫内,待妊娠生产后得到移植小鼠。结果对88只4周龄雌性C57BL/6小鼠进行超数排卵处理,见栓62只,共取得单细胞胚胎510枚、2细胞期胚胎400枚、囊胚35枚,采用输卵管伞部移植、输卵管剪口和子宫移植,共移植假孕母鼠43只,妊娠生产39只,产仔361只。结论输卵管伞部移植与输卵管剪口移植比较无显著差异,输卵管伞部移植对动物伤害较小,但对术者要求较高;输卵管剪口移植操作较快捷,但对动物损伤较大;子宫移植的妊娠效果最好,处于这一阶段的胚胎极易着床。     

DAP 玻璃化冷冻液对小鼠2-细胞胚胎的冷冻保存

摘要: 目的探索和优化小鼠2-细胞胚胎冷冻效果,建立小鼠胚胎冷冻保存技术以及超低温保存模型动物胚胎实验室所需的相关技术。方法选择3 个品系( C57BL/6、ApoE － / －、NOS3 － / － ) SPF 级4 周龄雌性小鼠,运用超数排卵、体外受精、玻璃化冷冻法,以及二细胞期胚胎复苏、体外培养等技术方法,观察上述实验效果。结果C57BL/6、ApoE － / －、NOS3 － / － 3 个品系小鼠超数排卵平均值分别为42. 98 个/只、27. 93 个/只、23. 11 个/只,体外受精2-细胞期胚胎率分别为68. 79%、32. 70%、23. 08 %,胚胎冷冻复苏后胚胎回收率72. 77%、80. 87%、83. 33%,存活率分别为56. 92%、54. 84%、70%,存活胚胎体外培养发育到囊胚比率分别为72. 37%、60. 78%、25%。结论选择4 周龄小鼠,按预定相同的技术方法做超数排卵、体外受精、胚胎冻存、胚胎复苏,呈现出较好效果,C57BL/6 小鼠优于基因工程小鼠,基本建立起小鼠2-细胞胚胎冷冻保存技术。     

巢式PCR-HRM法在点突变模式小鼠基因分型中的应用

目的 利用巢式PCR结合高分辨率熔解曲线(HRM)技术，改进点突变模式小鼠的基因分型方法。方法 以ob/ob鼠和db/db鼠为样本，剪小鼠脚趾编号并提取基因组DNA。根据突变位点参考序列设计巢式PCR引物并进行两轮扩增后，对产物进行HRM分析，获得基因分型结果。同时，通过PCR-SBT法和PCR-RFLP法对分型结果的准确性进行验证。结果 对80只ob/ob鼠和65只db/db鼠进行了检测，巢式PCR-HRM法能够准确地分辨出3种基因型。在ob/ob鼠中，鉴定得到的纯合子、杂合子和野生型分别为21、47和12只。而在db/db鼠中，纯合子、杂合子和野生型分别为23、33和9只。巢式PCR-HRM法的分型结果与PCR-SBT法和PCR-RFLP法的结果高度一致，且分型结果与小鼠表型一致。结论 建立的巢式PCR-HRM法是一种快速、简便、准确度高的基因分型方案，适用于大批量点突变模式小鼠的基因分型鉴定。     

5种不同遗传背景绿色荧光蛋白(GFP)基因导入系小鼠的培育

通过反复回交——筛选目的基因的手段,将C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J转基因小鼠的绿色荧光蛋白基因(GFP)分别向BABL/C、CBA/J、DBA/2J、AKR/J、FVB/J等品系小鼠导入,得到了5种不同遗传背景且带有GFP基因的导入系小鼠.冰冻组织切片等方法显示GFP导入系小鼠的皮肤、肝、肾、心、肺等均有不同程度的绿色荧光蛋白表达,不同遗传背景对GFP的组织表达谱、血液生理指标及繁殖性能未见影响.本实验采用基因导入法培育了5种新的带有GFP导入系小鼠,这些不同遗传背景的基因导入系小鼠为移植生物学研究提供了材料.     

小鼠Bpi条件基因打靶载体的构建和鉴定

目的构建小鼠Bpi条件基因打靶载体,为建立Bpi条件基因打靶小鼠模型和深入研究Bpi基因功能奠定基础。方法采用Cre/LoxP系统,选择小鼠Bpi基因第2、3外显子作为条件性敲除的目的片段,并在其两侧插入LoxP位点;运用LA-PCR技术,以129品系小鼠ES细胞基因组DNA为模板分步扩增包括Bpi第2、3外显子(中间同源臂)和上游同源臂在内的3.1 kb基因片段以及下游同源臂4.9 kb基因片段;构建pBSKⅡ-5SLoxP和ploxPFRTNeo-3L重组质粒,将前者酶切产物(3.1 kb)与酶切后的ploxPFRTNeo-3L质粒相连获得Bpi条件基因打靶载体。结果经多个限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的pBSKⅡ-5SLoxP、ploxPFRTNeo-3L重组质粒和Bpi条件基因打靶载体结构正确,与设计相符。结论成功构建了小鼠Bpi条件基因打靶载体。     

PP2A Cα敲除小鼠心肌细胞模型的构建

体外构建PP2A Cα敲除的原代小鼠心室肌细胞模型.选择性地将雄性PP2A Cαfl/fl,Cre/-小鼠与雌性PP2ACαfl/fl,Cre/-小鼠交配.新生小鼠心脏经胰酶消化后差速贴壁获得原代小鼠心室肌细胞,用带有Cre的腺病毒侵染心肌细胞,经荧光显微镜观察和Western-blot检测,分析PP2A Cα的敲除效果.将基因型为PP2A Cαfl/fl,Cre/-的雌雄小鼠进行交配,得到其同样基因型的后代,进而可获得足量基因型为PP2A Cαfl/fl,Cre/-的原代小鼠心肌细胞.用带有重组酶Cre的腺病毒侵染细胞48 h后,可见带有绿色荧光的心肌细胞;Western-blot检测显示,PP2A Cα在Cre腺病毒侵染的心肌细胞可下调60%～80%.本研究成功建立了PP2A Cα敲除的原代小鼠心肌细胞模型.     

Smad2基因敲除小鼠冷冻胚胎库的建立

目的 建立Smad2基因敲除小鼠胚胎库。方法 利用OPS法对Smad2基因敲除小鼠胚胎进行玻璃化冷冻保存,并比较不同杂交组合小鼠的超数排卵数、解冻胚胎的复苏率及发育率。结果 两组不同杂交组合（Smad2^＋/－♂×Smad2^＋/－♀和Smad2^＋／－×Smad2^＋／－♀）小鼠平均超排卵数分别为14．13枚和24．60枚;复苏率分别为90．16％和91．67％;囊胚发育率分别为73．08％和77．05％。这些结果表明Smad2基因敲除杂合子母鼠的超排数量明显低于野生型母鼠的超排数量,而二者胚胎解冻后的复苏率和囊胚发育率没有显著差异。因此我们主要通过对野生型小鼠超数排卵,然后与Smad2基因敲除杂合子雄鼠交配的方法获取胚胎,进行玻璃化冷冻保存,现已冻存胚胎1256枚。结论 成功建立了Smad2基因敲除小鼠胚胎库。     

长期高脂饮食对C57BL/6小鼠冠心病相关基因表达的影响

笔者运用基因芯片技术研究长期高脂饮食对C57BL/6小鼠冠心病相关基因表达的影响,探究长期高脂饮食导致小鼠冠心病发生的分子机制.选用12只4周龄C57BL/6雄性小鼠,随机分为正常饮食组(C)和高脂饮食组(H)各6只,分别喂饲标准饲料和高脂饲料16周.随后提取每组小鼠骨骼肌组织进行基因芯片分析并对数据进行统计.C与H组共708个差异表达基因,其中表达上调基因417个,表达下调基因289个.疾病(Disease)分析结果显示4个与心血管疾病密切相关的基因分别为APOC3,APOD,ADM,PTGIS.2个与冠心病密切相关基因分别为MGP,APOC3.长期高脂饮食可以引起C57BL/6小鼠冠心病相关基因表达的显著变化.