无形体分泌蛋白Ats-1与宿主细胞互作蛋白筛选及其生物信息分析

目的筛选与无形体Ats-1互作的THP-1宿主细胞蛋白,为揭示病原体侵袭宿主的致病机理提供科学数据。方法利用分子克隆法构建p GBKT7-ats-1诱饵质粒并转化酵母Y2HGold,验证诱饵质粒是否有自激活、毒性现象;制备THP-1细胞c DNA并连接到p GADT7-Rec上,转化酵母Y187并鉴定c DNA文库质量;酵母双杂交筛选与Ats-1互作的宿主细胞靶蛋白,通过GO、String生物信息分析细胞靶蛋白可能的生物学过程。结果成功构建诱饵质粒;cDNA文库容量4×10~6克隆,插入片段100～3 000 bp,且无污染,达到建库质控要求;酵母双杂交结果显示,与Ats-1蛋白互作的宿主细胞靶蛋白7个,分别是真核延伸因子1复合体α1亚基(EEF1A1)、TIMP金属蛋白酶抑制子1(TIMP1)、锌指蛋白36,C3H样2 (ZFP36L2)、半乳糖凝集素1(LGALS1)、前胸腺素α(PTMA)、WBSCR22、吸引素(ATRN)。生物信息分析显示,与Ats-1互作的宿主靶蛋白主要参与细胞分化增殖、细胞凋亡、自噬、炎症等生物学过程。结论病原诱饵蛋白与宿主细胞靶蛋白互作是一种细胞-细胞间发生信号联系的分子水平生物学过程,可能影响病原粘附、侵袭及胞内生存,最终导致疾病发生及临床症状出现。     

酵母双杂交系统筛选与HCMV pUL23蛋白相互作用的蛋白质

将UL23基因的ORF序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒pGBKT7-UL23,用酵母双杂交技术筛选人胚肾cDNA文库中与人巨细胞病毒pUL23相互作用的宿主蛋白分子,再通过回复酵母双杂交再次确认两者之间的相互作用.结果表明:酵母双杂交,回复酵母双杂交试验证明宿主蛋白分子elF3e(eukaryotic trans-lation initiation factor 3,subunit E interacting protein)能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用.宿主蛋白分子elF3e能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用,这为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.     

产酸克雷伯氏菌基因组文库的构建及鉴定

为了给基因功能研究提供基础,以pWEB~(TM)质粒构建产酸克雷伯氏菌KO108基因组文库,克隆数目为1 329个。通过EcoRⅠ酶切分析随机挑取的20个文库克隆的重组质粒,结果显示所有质粒均有8.2kb载体条带同时含有外源DNA,且外源DNA的带型并不相同,这表明所构建的KO108基因组文库中插入的外源DNA随机性较好。分析外源DNA电泳条带的大小,结果显示克隆的外源DNA片段最小约为25kb,最大约为50kb,平均大小估算为40kb,文库克隆容量约52Mb,证明该基因组文库包含基因组任意一个基因的概率为99.8%,是KO108基因组覆盖率的5倍。该文库的构建为产酸克雷伯氏菌功能基因克隆和比较基因组学研究奠定了基础。     

大肠杆菌guaC基因的克隆及高效表达

以E.coli MC4100染色体DNA为模板使用PCR扩增技术克隆了鸟苷酸还原酶基因guaC，该基因全长1044bp，编码相对分子质量为37ku的蛋白质。将该基因直接克隆于PET—16b质粒的T7启动于下游，得到质粒pEXP1。转化E．coli BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明，鸟苷酸还原酶的活性为不含质粒的宿主菌的80-85倍。     

带有TAT-PTD跨膜转导域融合基因的原核表达及表达条件优化

为构建pGEX-TAT-GFP原核表达质粒并优化GST-TAT-GFP表达条件,将PCR扩增的基因TAT-GFP克隆至质粒pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并优化表达条件,表达产物进行SDS-PAGE、Western blot及荧光学特性鉴定.结果表明:构建的质粒经PCR、酶切和DNA测序正确,含有重组质粒的宿主菌经过IPTG诱导表达分子量约为54.3 kD的融合蛋白GST-TAT-GFP,并经优化确定最佳的诱导表达条件.     

FTH1在布鲁氏菌侵染宿主细胞中的作用

为了探究布鲁氏菌侵染宿主巨噬细胞过程中铁蛋白(FTH1)生物学功能,本研究根据FTH1蛋白核苷酸序列,分别设计4条特异性小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)分子,亚克隆到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen载体,并转染RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR筛选干扰效果最优的质粒;布鲁氏菌侵染干扰前、后的RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR检测布鲁氏菌基因16S rRNA和细胞凋亡相关基因的mRNA表达量。结果显示:获得了4条特异性siRNA分子,经测序正确,pSIREN-C siRNA质粒对FTH1干扰效果最高可达98%。干扰后布鲁氏菌侵染抑制率为84%,凋亡相关基因的mRNA表达量5个降低,3个上升。本研究表明:FTH1基因沉默后布鲁氏菌胞内的生存能力下降;布鲁氏菌侵染可以抑制细胞凋亡发生,FTH1基因沉默后细胞凋亡升高。     

质粒和发酵工业

发现细菌中的质粒(Plasmid)已经有40年的历史了,开始只在大肠杆菌中发现有质粒,现在已普遍接受大多数细菌都有质粒这样的观点了,质粒的定义正在被推广,泛指那些不依附于细菌染色体,能够稳定遗传的DNA分子。质粒是分子水平的生命体,对宿主细菌并非必需的,然而有的质粒能够赋予宿主某些遗传特性,如抗药性,降解有机物,产生细菌素、致病性等,增加细菌对环境的适应力。 70年代,质粒生物学发生了重大变革。质粒首次被作为基因载体,在原核细胞中表达了真核基因,显示出了质粒对物种改造的巨大潜力,并终于导致了70年代后期生物工程(Biotechnology)的兴起。传统的发酵工业也受到了冲击,发酵工业不再是“发酵技术”     

新基因hSSB1逆转录病毒载体的构建、鉴定和稳定株的筛选

 hSSB1 (Human Single strand DNA binding protein) 是参与细胞DNA损伤应答的一个重要信号分子。根据GenBank 提供的hSSB1基因序列扩增其cDNA序列,插入到pBABE逆转录病毒载体中, 连接后的质粒转化后经过双酶切,PCR扩增及测序来鉴定pBABE-hSSB1阳性克隆。将阳性表达的pBABE-hSSB1和包装质粒转染到HEK293T细胞中,产生病毒液。将包装好的病毒感染细胞并用嘌呤霉素(puromycin)筛选稳定表达hSSB1的细胞株。重组pBABE-hSSB1质粒经双酶切,PCR扩增鉴定及DNA测序分析等方法证实克隆成功。Western blotting检测发现转染重组质粒pBABE-hSSB1的细胞株中hSSB1蛋白的表达水平高于对照组。该研究成功构建了针对hSSB1基因的逆转录病毒载体(pBABE-hSSB1),并得到了稳定高表达hSSB1的细胞株, 为深入研究其功能奠定了基础。     

类人弹性蛋白在大肠杆菌中的高效表达

类人弹性蛋白是由VAPGVG六肽重复序列构成的多肽。研究通过全基因合成获得上游引入NcoI和下游引入XhoI限制性内切酶位点的[(VAPGVG)3S]4基因编码序列,通过定向递归连接技术在pMD19-T simple克隆载体中构建[(VAPGVG)3S]32基因编码序列。利用NcoI和XhoI双酶切从重组克隆载体中回收[(VAPGVG)3S]32(ELPs)基因编码序列,在T4 DNA连接酶作用下与NcoI和XhoI双酶切处理的线性化载体DNA分子pET28a(+)重组,重组混合物转化大肠杆菌Top10感受态细胞。从添加有50μg·mL-1卡那霉素的LB平板上随机挑取37℃培养过夜的转化克隆,碱法小量抽提质粒DNA,经酶切及序列测定筛选出序列正确的重组质粒DNA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。从添加有50μg·mL-1卡那霉素的LB平板上随机挑取37℃培养过夜的转化克隆至新鲜配制的TB液体培养基中,于37℃、200 r·min-1培养至OD600约为0.60 h,添加终浓度为100μg·mL-1的IPTG诱导类人弹性蛋白表达3 h,SDS-PAGE凝胶电泳及Western blotting分析表明,该研究成功构建了类人弹性蛋白原核表达载体,在IPTG诱导作用下以可溶性状态高效表达。灰度扫描分析显示,重组类人弹性蛋白经IPTG诱导表达3 h后,可达宿主细胞可溶性蛋白的28.3%。该工作为以大肠杆菌为表达宿主,大量制备类人弹性蛋白用于生物医学材料奠定了良好的基础。     

粪肠球菌中具有启动功能的DNA片段的捕获及鉴定

PCR扩增来自质粒pUC119的β-内酰胺酶基因(bla)作报告基因,克隆进质粒pNZ8037上的能被Nisin诱导的启动子PnisA下游,构建了粪肠球菌启动功能片段探测载体pNZ-bla.利用该探测载体从粪肠球菌染色体总DNA中克隆到了能在粪肠球菌中表达的一系列具有启动功能的DNA片段,将包含克隆片段的pNZ-P-bla6质粒电击转化粪肠球菌,培养转化子并检测其抗氨苄强度,结果表明其抗氨苄强度大于Nisin诱导的含pNZ-bla质粒的粪肠球菌.表明克隆的功能片段启动能力强于PnisA.在pNZ-P-bla6的启动功能片段下游Sau3AⅠ和EcoRⅠ之间接上绿色荧光蛋白基因作为标记,构建表达绿色荧光蛋白的质粒载体pNZ-P-gfp并导入粪肠球菌中,共聚焦显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白的表达.     

制备12 kb重组质粒载体的方法

利用质粒载体pGEM-7Zf(+)克隆了一个长达9224bp的DNA片段,重组质粒大小达到12003bp.该重组质粒可以转化到JM109受体菌中,并且在随后的继代培养过程中具有较高的产量和相当高的稳定性.对于利用质粒载体来克隆DNA片段来说,设计的方法具有普遍的使用价值,对于较大的DNA片段克隆,该方法具有简便、可靠的特点,不仅能够保证克隆成功,而且极大的减少了筛选或鉴定重组菌的工作量.     

Q&A

<正>Q:基因工程用的目的基因如何从基因文库中准确获取?(读者:杨博)A:DNA文库是一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群。在构建文库的时候,我们先提取某一生物体的基因组DNA,然后用限制性内切酶把基因组DNA剪成很多片段,这些片段大小适中,通常为一两万个碱基对,以便于后续处理。接下来通过连接酶把这些片段和载体连起来。载体是一类人工改造过的DNA分子,通常为环状。片段化了的DNA必需和载体连接,因为载体能为这些DNA片段提供复制等能力。由于这一物种的基因组DNA被片段化了,每一个片段和一个载体连成了一个克隆     

渗调修复黄瓜陈种子基因组DNA损伤的RAPD研究

用Vc，CaCl2，PEG及其组合对自然老化的黄瓜种子进行渗调处理，利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对处理前后的种子基因组DNA多态性进行比较分析．结果表明：渗调作用可以修复黄瓜陈种子的DNA损伤．修复效果与种子贮藏时间有关，贮藏半年的种子渗调处理前后RAPD产物差异不明显，贮藏1～2a的陈种子修复的效果好，表现为分子量高的DNA重新合成，RAPD扩增条带增多，亮度增加；贮藏3a的陈种子修复效果不理想。     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及真核表达质粒pIRES-Ag85B的构建

目的:克隆并构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,为进一步研究其在开发新型的结核病疫苗和结核病免疫诊断试剂奠定了基础。方法:采聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85B基因,然后用双内切酶消化PCR产物和pIRES质粒,用T4 DNA连接酶连接后,转化入感受态E.coli DH5a,产物铺AmpR抗性的平板,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定并进入blast网页比对测序的序列。结果:酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符,测序比对后结果与目的基因完全一致,证实符合表达框架。结论:成功地克隆并构建Ag85B基因的真核重组表达质粒pIRES-Ag85B。     

人扁桃体淋巴细胞cDNA质粒重组体的构建

目的：通过构建人扁桃体淋巴细胞cDNA质粒重组体，为深入研究淋巴细胞的生物学功能奠定实验基础。方法：采用DNA重组技术，以人新鲜扁桃体淋巴细胞为实验材料从中提取mRNA，以mRNA为模板合成cDNA，然后与质粒pSPORTI进行定向连接并转入到E．coliJM109中进行分子克隆。结果：阳性克隆占90％，阴性克隆占10％；转化率为1．35×104克隆／微开连接体系；插入片段长度为0．5～2．3Kb，平均1．3Kb。结论：人扁桃体淋巴细胞cDNA质粒重组体构建成功。     

滑膜肉瘤融合基因SYT-SSX cDNA的克隆与序列分析

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法获得SYT-SSX的cDNA，克隆入PUCm-T载体后，在美国ABI DNA自动测序仪上以反向引物测序法进行核苷酸序列的测定，扩增出98bp的特异性片段，并筛选出阳性重组克隆质粒PUCm-SYT-SSX。获得的滑膜肉瘤融合基因SYT-SSX的cDNA，为深入揭示滑膜肉瘤分子发生机理奠定基础，同时可进一步完成原核表达。     

盐生盐杆菌含耐盐相关基因DNA片段的克隆

将盐生盐杆菌总DNA的BamHI不完全酶切片段与质粒pUC19连接成重组质粒,并以重组质粒转化E.coli JM101.经X-Gal-IPTG法筛选白色重组子,结合高盐平板检测,已经获得了3株比原受体菌的耐盐性提高30％－67％的转化子。重组质粒酶切电泳分析表明,被克隆的盐生盐杆菌含耐盐相关基因的DNA片段长度在1．0－3．5kb之间。     

高等植物线粒体DNA的多型性

近年来在分子水平上对高等植物线粒体DNA进行了大量的研究,提出了新的概念。高等植物线粒体DNA是多型性的,这是由特殊的重组系统所导致的。质粒状DNA分子有似于转座因子和质粒DNA的特性。     

结核分枝杆菌ESAT6基因真核表达载体的构建及表达

为了研究结核杆菌毒力因子ESAT6在结核杆菌感染细胞过程中的功能。采用分子生物学方法,根据Gen-Bank中登录的结核杆菌H37Rv的ESAT6基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到ESAT6基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM18-T载体中,测序验证后,再将ESAT6基因亚克隆至pEGFP-N1中,经核苷酸序列测定和酶切鉴定获得重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6。用重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6转染293T细胞。结果显示:重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6测序结果正确,转染细胞后出现绿色荧光,经Western blot分析鉴定,可见约35kDa的预期蛋白条带,证实ESAT6-EGFP融合蛋白在293T细胞中获得了表达。研究结果为进一步研究毒力因子ESAT6在感染宿主细胞中所发挥胞内生存机制奠定了基础。     

重组人骨形态发生蛋白4在毕赤酵母中的表达研究

试图建立人骨形态发生蛋白-4在毕赤酵母(Pichia pastoris) 中的表达技术.包括:将hBMP4成熟片段从全长cDNA亚克隆到分泌型表达载体质粒pPIC9K多克隆位点上,构建能表达rhBMP4的载体质粒pPIC9K-hBmp4.经转化Pichia pastoris宿主菌株GS115,PCR鉴定基因整合后,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达上清液经SDS-PAGE和Western-blot 分析,结果表明rhBMP4以单体形式分泌到发酵上清液中,单体分子质量大小约为26 ku,摇瓶表达量达到20.13 μg/mL.