有机磷水解酶的大肠杆菌细胞表面展示

PCR扩增来自黄杆菌ATCC27551的有机磷水解酶基因opd,直接与XcmⅠ酶切去除Ampr基因片段的pZXL-T连接,将opd克隆于锚定单元Lpp-OmpA编码序列下游,转化E.coliBL21(DE3).经抗性筛选、PCR鉴定和测序证实,成功构建了具有全细胞催化效应的大肠杆菌细胞表面展示工程菌.SDS-PAGE结果表明,工程菌能表达产生51 kD的融合蛋白.细胞表面展示的有机磷水解酶具有较高全细胞酶活性,用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低90%.     

优化合成有机磷水解酶opd p基因在毕赤酵母中的表达

拟验证通过密码子优化有机磷水解酶(opd)基因,和生物砖方法构建opd多拷贝载体,以提高在毕赤酵母中的表达量.将原始的opd基因依照毕赤酵母偏爱密码子设计合成新的有机磷水解酶基因,并在C端添加了6个His-Tag融合蛋白标签.所合成的opd p基因全长1 149 bp(base pair).基因克隆入p HBM905BDM毕赤酵母表达型质粒,成功构建重组表达质粒p HBM905BDM-opd p,以及多拷贝表达质粒p HBM905BDM-opd p-2C,p HBM905BDM-opd p-3C,p HBM905BDMopd p-4C,转化毕赤酵母感受态细胞GS115.实验结果表明,经甲醇诱导后,在AOX1(乙醇氧化酶基因)启动子调控下,获得OPD P蛋白分泌表达,Western Blot检测4个转化的菌株中都表达了目的蛋白,且两拷贝表达量较一拷贝有提高,达到0.2 U/m L.但是随着拷贝数的进一步增加表达量呈现下降的趋势.     

重组人乙酰胆碱受体α亚基的克隆及初步表达

为获得高表达的人乙酰胆碱受体 (human acetylcholine receptor,Ach R)α亚基蛋白 ,根据已知的乙酰胆碱受体α亚基序列 ,设计并合成了一对引物 ,以含乙酰胆碱受体α亚基 DNA的重组质粒 p UC- Ach R为模板 ,应用PCR技术 ,扩增乙酰碱受α亚基的片段。将该扩增片段与载体 p ET32 M分别用 Bam HI/ Hind III双酶切 ,然后在T4 DNA连接酶作用下 ,将乙酰胆碱受体α亚基片段插入载体 p ET32 M中 ,且与载体中的硫氧还蛋白 (约 14 k D)基因融合。重组质粒 p ET32 M- Ach R含 T7启动子 ,为 IPTG诱导型。经双酶切鉴定 ,序列测定及工程菌初步表达分析 ,表明获得了正确的重组质粒 p ET32 M- Ach R,且在大肠杆菌 BL2 1中有明显表达 ,硫氧还蛋白 -乙酰胆碱受体融合蛋白的分子量约 37k D,但主要以包涵体形式存在。     

变形杆菌脂肪酶在大肠杆菌细胞表面的展示表达及重组酶的特性

在生物转化处理工业中利用细胞表面展示技术表达脂肪酶作为一种全细胞催化形式具有很大优势,因为脂肪酶展示在细胞表面作为一种固定化酶.以超折叠绿色荧光蛋白的羧基端结构域作为锚定区,构建变形杆菌来源的脂肪酶与羧基端结构域的融合基因.将融合基因插入到p ETsf GFP表达载体中,得到表面展示载体p ETsf GFP-Lip A.将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta-Blue宿主菌中经自诱导后,利用免疫荧光显微技术和流式细胞仪分析确定脂肪酶成功展示于大肠杆菌细胞表面.重组酶的最高酶活达到7 009 U/g干细胞,最适反应温度和p H分别为为37℃和8.0,表面活性剂Tirton X-100、Co~(2+)和Ni~(2+)能显著提高脂肪酶的酶活,60%丙酮处理该酶18 h后脂肪酶残余酶活性为104%,60%乙醇处理该酶18 h后脂肪酶残余酶活性为117%,表明脂肪酶对有机试剂具有很好的耐受性.以上实验结果表明:细胞表面展示技术表达脂肪酶的最大优点为工业化应用提供了坚实的基础.     

瑞替普酶在乳酸乳球菌中的表达

为建立溶栓药物瑞替普酶(r PA)的乳酸菌表达系统,从实验室前期构建的大肠杆菌表达质粒p ET22b-rpa上扩增出目的基因rpa,将该基因与乳酸菌表达质粒pCYT连接,构建了pCYT-rpa质粒.此外,为提高r PA在乳酸乳球菌NZ9000中的稳定性,同时构建了rpa位于葡萄球菌(Staphylococcal)耐热核酸酶基因nuc下游融合表达的重组质粒pCYT-nuc-rpa.将质粒p CYT-rpa和p CYT-nuc-rpa分别电转化至乳酸乳球菌NZ9000中,经Nisin诱导表达,Western blot结果显示Nuc可提高r PA在乳酸乳球菌中的稳定性,从而增加了rPA在乳酸菌中的表达量.重组r PA及Nuc-rPA在复性后均具有溶栓活性,活性分别为800,U/L和1,000,U/L.     

类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性

目的 构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELP-mCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法 对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,构建重组质粒pET28a-ELP-mCherry;将重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中,诱导表达ELP-mCherry融合蛋白;利用可逆转变循环(ITC)法对ELP-mCherry融合蛋白进行纯化;通过MTT法探讨ELP-mCherry融合蛋白与人胚肾上皮细胞HEK293T和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的细胞相容性.结果 DNA测序结果 显示成功构建了ELP-mCherry原核表达载体;利用BL21(DE3)大肠杆菌表达系统成功表达ELP-mCherry融合蛋白,通过ITC法纯化得到了高纯度融合蛋白.MTT结果 表明:在所有ELP-mCherry蛋白测试浓度下,HEK293T和NIH3T3细胞存活率接近或超过100％.结论 成功构建ELP-mCherry原核表达载体,成功表达并纯化得到高纯度的ELP-mCherry融合蛋白,ELP-mCherry融合蛋白在HEK293T和NIH3T3细胞中具有良好的细胞相容性.     

GST-NAP融合蛋白可溶性表达及柱上切割GST标签

利用基因工程的方法,以实验室保存的p MAL-C2X-NAP质粒为模板,PCR扩增NAP基因,构建重组质粒p GEX-NAP.重组质粒通过酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),再经IPTG低温诱导获得可溶性GST-NAP融合蛋白,最后利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶树脂进行纯化,Prescission蛋白酶进行柱上切割去除GST标签.结果表明,p GEX-NAP重组质粒构建正确,在大肠杆菌中经IPTG低温诱导表达,可获得大量可溶性GST-NAP融合蛋白.Prescission蛋白酶柱上切割去除GST标签后,经Western Blot验证NAP蛋白能被兔抗NAP多克隆抗体特异识别.     

大肠杆菌丁醇生产菌的构建及检测

用合成生物学和代谢工程技术,筛选并克隆丁醇合成途径中酶活性较高的atoB,hbd,crt,ter,adhE2等5个关键酶基因,先通过重组PCR构建pUC18-ato B-hbd-crt-ter质粒,再将串联基因atoB-hbd-crt-ter和基因adhE2克隆至质粒pET-21b中,构建含丁醇合成途径的表达载体p ET-21b-ato B-hbd-crt-ter-adh E2,将其转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中制备工程菌株.对样品进行IPTG诱导表达检测与色谱分析的结果表明,已合成出关键酶蛋白并产生一定量的丁醇.     

番茄ACC合酶(LeACS2)在大肠杆菌中的可溶性表达

植物激素乙烯参与了植物生长发育等一系列生理过程,通过控制乙烯的合成进而控制经济作物的衰老和果实的成熟,给农业带来深远影响.ACC合酶是高等植物乙烯生物合成的限速酶.通过RT-PCR将番茄ACC合酶(LeACS2)cDNA克隆至大肠杆菌表达载体pET30a中并使之与GST 编码序列进行融合而构建了重组表达质粒pET-LeACS2-GST.转化获得含有该重组表达质粒的大肠杆菌BL21 starTM(DE3) pLysS细胞,在IPTG的诱导下成功表达出含有LeACS2的大小约83 000的融合蛋白.该融合蛋白具有较好的可溶性.通过GST亲和层析和MonoQ阴离子交换两步纯化后的LeACS2能够催化其底物SAM生成ACC.     

重组嵌合生长抑素工程菌的构建、表达与免疫

将动物生长抑素(SS)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合基因插入p ET28a系统,构建重组质粒pET28a-A4030-2-LTB并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,获得了大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)p ET28a-A4030-2-LTB,然后使用SDS-PAGE检测该融合蛋白的表达并优化其发酵与包涵体洗涤条件,接着采用亲和层析法进行纯化,并用Western Blotting技术检测该融合蛋白的免疫原性.研究结果表明,在37℃,加入1 mmol/L的IPTG培养3 h后,融合蛋白的表达量最高且稳定表达;在包涵体洗涤的过程中,使用含有φ=1%的Triton X-100、2 mol/L尿素和0.5 mol/L NaCl的缓冲液洗涤包涵体沉淀,其效果最佳,用Western Blotting方法检测出该蛋白能发生抗原抗体反应,并且将重组蛋白免疫7只小鼠后,其中有6只小鼠产生了抗SS抗体,表达产物具有免疫原性.此研究为进一步开发生长抑素基因工程疫苗提供了可靠的实验依据.     

小鼠Pem-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：为制备重组小鼠Pem（以下简称mPem）-谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白，作为研究mPem蛋白功能的材料，方法：根据携带小鼠Pem基因编码序列的模板质粒pEGFP/mPem设计合成特异性引物，PCR扩增小鼠Pem基因编码序列，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-3中，得到重组表达质粒pGEX-4T-3/mPem，用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，IPTG诱导重组菌表达mPem蛋白，SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达产物。结果：重组菌株明显诱导表达出预期相对分子质量49000的融合蛋白。结论：成功构建了mPem-GST原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达出mPem-GST融合蛋白，为mPem蛋白功能的研究打下了基础。     

Catalase-TAT的融合表达与表征

利用RT-PCR技术从人的肝细胞中克隆出成熟蛋白过氧化氢酶(catalase)的基因,通过PCR将其与TAT基因融合形成融合基因(catalase-TAT);将catalase-TAT基因构建到表达质粒pET21a(+)中,转入大肠杆菌Rosetta2(DE3);通过IPTG诱导,转化子成功表达出catalase-TAT融合蛋白.重组菌发酵菌体破碎液经过硫酸铵沉降和Sp-5pw阳离子交换色谱,分离得到电泳纯的目的蛋白,其纯化倍数为18.51倍;经理化性质分析确定了此融合蛋白的最适pH和温度稳定性;细胞实验表明融合蛋白catalase-TAT能够明显提高胞内的过氧化氢酶活性.     

多角体蛋白对植酸酶的包埋

植酸酶是水解植酸及其盐类生成肌醇和磷酸的一类酶的总称。作为一种新型饲料添加剂,植酸酶在动物营养及环境保护等领域具有很大的应用潜力。为了获得高活性的植酸酶app A,首先将app A基因克隆到载体p Fast Bac Dual中,构建转移载体p Fast Bac Dual-polyh-app A;然后转化大肠杆菌Escherichia coli DH10Bac感受态细胞;通过位点特异性转座,将app A基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建表达质粒Bacmid:Ac-polyh/app A。最后,通过脂质体将表达质粒转染Sf9昆虫细胞。Western blotting和酶活测定法对app A的表达和活性进行分析,结果表明在昆虫细胞中app A酶表达成功,植酸酶能够被包埋进多角体内部,并具有较好的植酸酶活性,为植酸酶大规模生产和应用提供了可参考利用的技术。     

单核细胞增生性李斯特菌srtA基因的克隆与原核表达

为了探究从新疆发病绵羊中临床分离的单核细胞增多性李斯特菌(简称LM90SB2)srt A基因的特异性及其在原核表达质粒p ET32a中的表达,本研究利用PCR技术扩增LM90SB2的srt A基因,测序后并进行序列比对分析,将其克隆到原核表达质粒p ET32a中构成重组表达质粒p ET32a-srt A。重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导使其表达,SDS-PAGE电泳检测,同时采用Western-blotting对表达产物进行了鉴定。结果表明:Srt A蛋白在BL21(DE3)中大量表达,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测分析其为1个分子量为47 ku的融合蛋白,与预期的大小相符合,成功的构建了重组质粒p ET32a-srt A,并使其在BL21(DE3)中获得了高效的表达。本研究为下一步研究其对李斯特菌致病性的影响及制备单克隆抗体奠定了基础。     

GST-UCP2-N和GST-UCP2-C原核表达载体的构建表达及多克隆抗体的制备

以pMD18-T-hucp2为模板,用设计的两对特异性的引物PCR得到hucp2cDNA N端和C端的两断基因片段,然后将其插入到pGEX-5X-1表达载体上,重组质粒在PCR、双酶切、测序鉴定后,经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21表达大量融合蛋白GST-UCP2-N(C),经GST亲和层析纯化蛋白.以该蛋白为抗原免疫ucp2基因敲除小鼠,western blot鉴定血清中抗体的反应性.实验证明成功构建了构建pGEX-5X-1-UCP-N(C)重组质粒,表达出了融合蛋白.并获得了抗血清.为进一步获得灵敏性更高,特异性更强的UCP2的抗体打下了基础.     

表达HIV-1复合多表位基因的p815细胞稳定株的建立和评价

建立稳定表达HIV-1p24MEG复合多表位基因的p815细胞克隆.设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入pcDNA3.1(+).在阳离子聚合物作用下重组真核质粒转染的p815(H-2d)细胞, 以G418压力筛选,RT-PCR检测mRNA表达,间接免疫荧光检测蛋白表达.通过PCR获得了HIV-1 p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG融合基因,成功构建了p24MEG基因的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/p24MEG.转染p815细胞后, RT-PCR检测到融合蛋白mRNA表达,间接免疫荧光显示 p815细胞内有融合蛋白的表达.结论:建立了稳定表达HIV-1p24MEG融合蛋白的p815细胞克隆,为评价多表位抗原p24MEG在BALB/c小鼠体内诱导的细胞免疫应答奠定基础.     

鱼腥藻PCC7120α质粒上的parD/E同源基因all7155/asl7156的克隆及表达

为研究鱼腥藻PCC7120质粒上毒素抗毒素系统的蛋白质性质和相互作用,根据NCBI中PCC7120的α质粒上的all7155和asl7156基因数据,通过降落PCR克隆了目的基因(all7155/336 bp,asl7156/258 bp).将目的基因片段连接至p MD18-T构建了克隆载体,蓝白斑筛选了阳性克隆,经双酶切纯化后将目的基因连接至表达载体p ET30a(+),并转入表达菌BL21中,测序后证实构建成功,并利用IPTG诱导进行了表达.通过NCBI的BLAST蛋白比对,发现了all7155和asl7156与已知的Par D/E毒素抗毒素系统同源,可通过对此基因的克隆,表达和蛋白性质来进一步认识Par D/E系统.     

pPET-SUMF2各亚型的原核质粒构建及蛋白表达

构建人硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因各亚型的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达pPET-SUMF2各亚型的融合蛋白。用EcoRI和XhoI双酶切人SUMF2各种亚型基因及质粒pPET-30a;将2种酶切产物按常规方法连接、转化至大肠杆菌DH5α。挑取菌落培养,提取质粒进行验证。将构建成功的pPET-SUMF2各亚型重组表达质粒转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析以及Western blot检测SUMF2各亚型的融合蛋白表达。成功构建了pPET-SUMF2各亚型的重组表达质粒,并成功诱导SUMF2各亚型融合蛋白的表达,Western blot结果显示在预期位置有特异蛋白条带表达,并在BL21(DE3)内表达了SUMF2各亚型的融合蛋白,为进一步研究SUMF2的功能以及SUMF2与哮喘发病的关系奠定了基础。     

c-Jun氨基末端激酶3结构域突变质粒的构建、鉴定与转染

为构建c-Jun氨基末端激酶3 (c-Jun N-terminal kinase3,JNK3)的p VP16-eGFP-Myc-JNK3活化环(activation-loop,A-loop)结构域突变型重组质粒,通过A-loop突变型JNK3的c DNA序列以及p VP16-eGFP-Myc的酶切位点设计引物,PCR扩增目的基因,使用限制性内切酶Mlu I与Xba I将基因克隆到p VP16-eGFP-Myc真核表达载体中,构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3(A-loop)结构域突变型重组质粒。转化后,通过双酶切鉴定与DNA测序判断是否成功构建重组质粒,使用Trans IntroTMEL Transfection Reagent转染人胚肾(human emborynic kidney,HEK) 293T细胞,通过荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况。结果表明:构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3 (A-loop)结构域突变型重组质粒,双酶切鉴定和测序结果显示构建成功; p VP16-eGFP-MycJNK3 (A-loop)成功转染HEK293T细胞且表达。鼠源JNK3结构域突变型质粒构建成功,对进一步研究JNK3结构域在相关疾病的作用和机制提供实验工具。     

酿酒酵母金属硫蛋白的表达、纯化及活性检测

通过PCR从酿酒酵母基因组DNA上扩增得到酿酒酵母基因CUP1编码的金属硫蛋白序列.将其编码序列克隆到质粒pTWIN1构建重组表达质粒pTWIN1-MT,转化大肠杆菌感受态细胞ER2566.重组融合蛋白CBD-intein1-MT在IPTG的诱导下得到表达,经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定.用重组菌分别进行铜离子耐受...