猪冠状动脉平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立体外分离培养猪冠状动脉血平滑肌细胞(PCASMC)的技术方法并观察其生长特征.方法:酶联合消化法原代分离猪冠状动脉来源的CASMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法测定冠状动脉PCASMC传代细胞的成活率和生长特征.结果:分离培养的细胞3d后呈梭形生长,7~8d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察3~5d即可见典型"峰-谷"状生长;免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率为97.5%;细胞生长曲线近似"S"形.结论:本研究建立了高效分离和培养PCASMC的方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型.     

猪冠状动脉平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立体外分离培养猪冠状动脉血平滑肌细胞(PCASMC)的技术方法并观察其生长特征.方法:酶联合消化法原代分离猪冠状动脉来源的CASMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法测定冠状动脉PCASMC传代细胞的成活率和生长特征.结果:分离培养的细胞3d后呈梭形生长,7~8d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察3~5d即可见典型"峰-谷"状生长;免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率为97.5%;细胞生长曲线近似"S"形.结论:本研究建立了高效分离和培养PCASMC的方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型.     

斑节对虾肝胰腺和血淋巴组织细胞的体外培养

用斑节对虾(Penaeusmonodon)的肝胰腺组织及血淋巴细胞进行了体外培养,结果表明肝胰腺细胞培养共传3代,促肝细胞生长因子效果不明显．血淋巴细胞原代培养很成功,血淋巴细胞90％多为贴壁生长,其中圆形悬浮生长细胞可见分裂相,少数瓶细胞传代6次,生长时间达半年之久,加入PHA后,对细胞没有明显刺激作用．     

大鼠半月板纤维软骨细胞的分离、培养与鉴定

探讨体外大鼠半月板纤维软骨细胞分离培养与鉴定的实验方法,观察不同代次间细胞的形态学特征.手术分离大鼠双膝内外侧半月板,采用胰酶和Ⅱ型胶原酶消化法提取细胞,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光法鉴定细胞,低糖DMEM完全培养液常规培养.结果表明,原代半月板细胞形态呈多角形,轮廓清晰,8～10d可铺满瓶底;传代后的1～3代细胞,其贴壁及增殖能力加强,生长状态良好;传至4～5代尤其是第5代之后,细胞表型不稳定,密度稀疏,形态以长梭形为主且不规则,清晰度下降,传代周期延长;细胞鉴定结果呈阳性.双酶消化和低糖DMEM完全培养液常规培养可以获得具有良好生物学特性的半月板细胞,第4代之前的半月板细胞可以为运动损伤的组织工程学研究提供种子细胞.     

兔和牛角膜上皮、基质及内皮细胞体外培养和增殖的研究

目的：研究兔和牛角膜上皮、基质及内皮细胞等3种细胞体外培养的生物学特性，探索和改进这3种细胞体外培养的方法，为组织工程角膜奠定基础。方法：采用消化法分离培养兔和牛角膜上皮、内皮和基质细胞，观察细胞贴壁生长情况，同时对生长良好的原代细胞进行消化传代，进一步观察传代细胞的形态和生长情况。结果：角膜上皮、内皮和基质细胞均在培养48～72h贴壁生长，培养6～9d能形成良好单层，细胞形态典型，进行多次传代后细胞仍维持原有形态和功能，获得的细胞能进行长期培养。结论：为兔和牛角膜上皮、内皮和基质细胞体外培养，提供了简单高效经济的方法。     

鹿茸组织和细胞原代培养和继代培养研究

本文对鹿茸皮肤及肉质部分组织块的培养及继代培养方法、从鹿茸各组织中分离细胞的方法及分离细胞的原代培养和继代培养进行了研究。由鹿茸皮肤细胞建立的细胞系已在体外培养了近四个月,传至第三十代,由鹿茸的肉质部分建立的细胞系已在体外传了二十几代。传代工作仍在继续。     

原代和传代培养的人输卵管上皮细胞对小鼠胚胎体外发育的影响

为了检测人输卵管上皮细胞对早期胚胎体外发育的影响，将小鼠２细胞胚胎与人输卵管上皮细胞进行体外共培养．结果显示：无论原代培养还是传代培养的人输卵管上皮细胞都可使胚胎发育率提高，发育速度加快．经传代４次以后的细胞对胚胎发育的促进作用有下降的趋势，所以传代第１至第４代是应用于共培养的最佳选择．同一代细胞中已贴壁稳定生长的细胞对胚胎发育的促进作用比刚经传代尚未贴壁的细胞大．     

树鼩胸主动脉血管内皮细胞的分离培养与鉴定

目的 体外分离、培养树鼩(Tupaia belangeri)胸主动脉血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs),并对培养细胞进行初步鉴定, 为新型实验动物树鼩的应用研究提供体外模型。方法 无菌取幼龄树鼩胸主动脉,采用组织块培养法和胰蛋白酶、胶原酶连续消化法分别进行树鼩胸主动脉血管内皮细胞分离,经完全培养液培养,倒置显微镜观察细胞形态,并用抗Ⅷ因子抗体进行荧光染色鉴定细胞。结果 经组织块培养法分离培养的血管内皮细胞,3 d有细胞贴壁,7 d后细胞从组织块中大量长出,15 d汇合为单层;酶消化法所得细胞12 h即贴壁,3～7 d生长较快,12 d汇合成单层,镜下观察发现细胞呈典型的铺路石状;两种方法分离所得原代细胞经体外培养传代,6代内,细胞生长均良好;利用血管内皮细胞标志分子Ⅷ因子进行免疫荧光鉴定后确定为阳性。结论 本研究采用简便的方法成功分离到了树鼩胸主动脉血管内皮细胞,为血管内皮细胞相关研究提供了实验模型。     

鹿茸整体液氮保存及复苏试验

本文对鹿茸的整体液氮保存及复苏进行了初步研究。结果表明:采用液氮冷冻和复苏方法,可使在液氮中保存一年半的鹿茸组织结构不受任何破坏,细胞仍可在体外培养增殖、传代[到目前(1990.1)已传至第十五代,现仍在继续传代]。     

条斑星鲽连续性鳍细胞系的建立与鉴定

为了建立条斑星鲽鳍细胞系,为其细胞工程及病毒学研究奠定基础,对经Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶联合消化法所得鳍组织碎块分别用DMEM/F12、L-15和M199培养液(pH7.2)在18～26℃进行了鳍组织的体外培养,并在所筛选出的最适培养液和培养温度下通过添加羧甲基壳寡糖、碱性成纤维样生长因子(bFGF)和I型胰岛素样生长因子(IGF-I)启动了鳍细胞的原代培养。体外培养结果显示,条斑星鲽鳍细胞的最适培养液为DMEM/F12培养液,最适培养温度为22℃,原代培养鳍细胞的生长分裂状态旺盛,细胞形态主要为成纤维样,20d后便可形成汇合细胞单层,经过连续的继代培养已建立了条斑星鲽的连续性鳍细胞系,目前已传至第135代;生长特性检测结果显示,第60代鳍细胞系细胞的群体倍增时间为56.9h,其生长分裂状态依然十分旺盛;染色体分析结果显示,第60代鳍细胞系细胞虽然出现了染色体的非整倍性,但其特征性染色体数目仍为46条,并具有2sm+44t的正常二倍体核型,证明所建立的细胞系确为条斑星鲽连续性鳍细胞系。该细胞系为条斑星鲽的细胞工程育种和病毒-细胞相互作用提供了一个理想的体外研究体系,具有重要的理论意义和应用价值。     

温度调控诱导尼罗罗非鱼仔鱼雄性化的研究

  罗非鱼Oreochromis spp.是我国重要的水产养殖品种。我国是世界最大的罗非鱼生产国和出口国。但罗非鱼性成熟早、繁殖过度,致使商品鱼品质偏低、资源浪费严重,解决途径为采用单雄性养殖。本文进行了温度调控诱导尼罗罗非鱼仔鱼雄性化的研究。较之前常采用的雄激素投喂方式更环保、安全、高效。控温处理开始时期为出膜后第7天（DPH, Days Post Hactching）,进行正交试验：设置3个温度20、28、36 ℃（±0.5 ℃）,3个控温时段7-14 DPH、7-21 DPH、7-28 DPH。主要结果如下：处理组合（温度+控温时段）为36 ℃+7-14 DPH、36 ℃+7-21 DPH、36 ℃+7-28 DPH时雄性率较对照组显著增高、与其它各组有显著差异（P<0.05）,分别高达93.85%、96.00%和96.92%,这3组间无显著差异（P>0.05）。为了解控温对仔鱼的影响,还同步研究了相应的增质量率和存活率。由控温时段结束至60 DPH的绝对增质量率来看：处理组合36 ℃+7-14 DPH、28 ℃+7-14 DPH与对照组无显著差异（P>0.05）;从存活率来看：只有处理组合20 ℃+7-21 DPH、20 ℃+7-28 DPH与对照组有显著差异（P<0.05）。综合来看,最佳处理组合为36 ℃+7-14 DPH,平均雄性率 93.85%、最高达96.96%,且高温（36 ℃）处理后生长和存活不受影响。     

鸡血藤提取物中缩合鞣质的含量测定及其抗肿瘤活性初步研究

 对鸡血藤/φ=60%醇提物及不同极性溶剂萃取物中总黄酮和缩合鞣质含量进行测定,并测定它们对肿瘤细胞增殖的抑制活性。采用紫外分光光度法测定各样品中总黄酮含量;采用香草醛硫酸法测定各样品中缩合鞣质含量,结果显示,鸡血藤/φ=60%醇提物、乙酸乙酯不溶物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水层留余物的总黄酮含量分别为（6.49±1.99）%、（7.36±0.13）%、（9.35±0.22）%、（8.41±0.27）%、（4.48±1.53）%;〖JP〗缩合鞣质含量分别为（5109±0.37）%、（52.34±4.73）%、（73.22±2.72）%、（83.11±5.87）%、（29.74±2.12）%。采用MTT法测定各样品对乳腺癌MCF-7和结肠癌HT-29细胞增殖的抑制活性,结果不同样品对HT-29和MCF-7细胞增殖表现出不同程度的抑制活性,其中正丁醇萃取物对肿瘤细胞增殖的抑制活性最强。     

基于PsbA-trnH,RbcL和trnL-F序列的野生葡萄系统发育

采用PCR技术从湘西地区的3种野生葡萄中分离PsbA-trnH、RbcL和trnL-F基因片段,克隆至pMD18-T载体中测序,结合GenBank/EMBL/DDBJ中公布的其他葡萄科植物相应cpDNA基因信息,使用Mega4构建系统发育进化树,分析其系统发育关系.结果显示,PsbA-trnH,RbcL和trnL-F这3种cpDNA基因序列均能用于葡萄科属间的分子鉴定,但结果与传统形态学分类存在一些差异,RbcL能用于葡萄属内种间的分子鉴定.     

云南红豆杉小孢子发生和雄配子发育的研究方法比较

 以云南红豆杉为实验材料,比较了石蜡切片法、洋红简易染色法和整体染色透明法研究小孢子发生过程的效果,分析了用石蜡切片法及离体培养法研究雄配子体发育优缺点.在离体培养中,对比了不同的蔗糖质量浓度、培养温度及染色方法对实验结果的影响,从而为针叶树种雄性生殖系统发育过程研究提供参考.结果显示:整体透明染色法操作简单,能够反应小孢子发育过程中各个阶段的细胞结构,是用于小孢子发育过程研究的比较理想的方法;对于雄配子体发育过程的研究,需要用石蜡切片法与离体培养法相结合,在离体培养中,采用雄球花表面灭菌,自然散粉,低糖低温培养有利于防止污染,洋红染色法方便快捷,不需要特别的设备,是离体培养时比较理想的染色方法.     

蛇足石杉内生真菌 TL 的分离鉴定与药敏研究

从蛇足石杉植株中分离出内生真菌,通过马铃薯培养基（PDA）培养菌株,利用三点接种法分离纯化,筛选出一株优势菌株TL作为供试菌株通过菌落形态和培养特性观察以及显微摄影技术进行形态观察,对照《真菌鉴定手册》,经鉴定为半知菌亚门( Amon imperfect fungi )丝孢纲（Hyphomycetes）丛梗孢科(Moniliaceae)单端孢属(Trichothecium Link ex Fries)通过单因素试验与正交试验相结合,最终发现对供试菌株具有最佳抑菌效果的药物浓度组合     

斑马鱼3种胰蛋白酶原基因的克隆、序列分析及组织表达

 胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶类超家族成员之一,在动物蛋白消化中起着重要作用。为深入研究胰蛋白酶在鱼类中的蛋白结构和生理功能,利用RT-PCR和RACE方法,成功获得了斑马鱼3种胰蛋白酶原cDNA序列(zftry1a、zftry1b和zftry2)。结果表明,zftry1a和zftry1b均有242个氨基酸残基组成,其中包括15个氨基酸的信号肽和5个氨基酸(LDDDK)的激活肽。zftry2由247个氨基酸残基组成,其中包括15个氨基酸的信号肽和9个氨基酸(APLGDDDDK)的激活肽。氨基酸序列比对结果显示,三者具备胰蛋白酶原的保守结构特征,如含有催化三联体氨基酸(His-57、Asp-102和Ser-195),12个半胱氨酸,位于底物结合口袋底部Asp-189和口袋开口处的Gly-216、Gly-226等。进化树结果显示,斑马鱼zftry1a和zftry1b属于group I,为阴离子胰蛋白酶原;斑马鱼zftry2属于group II,为阳离子型胰蛋白酶原。RT-PCR结果显示,三者组织分布模式类似,且在肠中有最高表达量。这些结果为研究鱼类胰蛋白酶原的基因进化和功能以及进一步探讨鱼类消化生理的分子机制奠定了基础。     

水稻胰蛋白酶抑制剂对褐飞虱产卵刺激的响应

 昆虫产卵过程对寄主植物的直接刺激包括产卵器的机械损伤和卵表面物质带来影响,这些刺激是启动植物诱导抗虫性的重要途径。通过对褐飞虱产卵处理后水稻植株内胰蛋白酶抑制剂（BBPI）合成酶基因的表达量及物质含量的测定,对比褐飞虱取食和机械损伤处理,发现褐飞虱产卵能够诱导水稻BBPI合成酶基因的表达和BBPI物质的生成。处理后6 h,12 h,水稻 BBPI 表达量显著高于取食和机械损伤处理;产卵诱导的BBPI物质含量显著高于正常水稻。褐飞虱产卵诱导水稻启动〖WTBX〗BBPI〖WTBZ〗表达和物质合成表明,与取食危害类似,水稻同样会对褐飞虱产卵刺激产生响应,启动相应的植物防御体系,进而达到阻滞褐飞虱危害的目的。     

转型期广州城市空间增长分异研究

研究了转型期广州城市空间增长分异规律,结果表明城市空间增长在旧城空间、城市边缘区、城市外围空间和区域性空间四个圈层表现出不同的特点,其中旧城空间表现出由计划经济时期综合性使用功能向商业、居住、办公等专业性功能分化;城市边缘区以居住和工业为主要的功能,采取圈层、轴向和填充的蔓延式增长方式;城市外围空间的以工业和基础设施为主要功能开发,采取综合性城市新区、新城等形式的跳跃式增长方式;城市增长出现向区域性空间的延伸,主要表现为基础设施建设上的功能延伸,包括兼并和竞合两种增长方式;广州城市空间增长分异是政府力、市场力、社区(集体)力3种力量综合作用的结果。广州城市空间增长分异对全国大城市空间增长分异具有代表意义,文章最后基于广州城市空间增长分异特征对转型期中国城市空间增长展开了讨论。     

一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及其酶学特性研究

 采用CMC平板筛选和刚果红染色等方法,从湖南科技大学校园腐烂木芙蓉根部土壤中分离1株产纤维素酶菌株CXB001,经生理生化测试、16S rDNA分子进化树分析,鉴定菌株为Bacillus velezensis。对该菌株的生物特性研究表明,其最适生长温度为37 ℃,在10~50 ℃,pH 5.0 ~11.0中能生长,在pH 6.0~9.0,34~40 ℃,1.5% ~3.5% NaCl 的培养条件下,最适产酶。CXB001所产纤维素酶最适反应温度为50 ℃,最适反应pH为5.0;在20 ℃、pH 5.0~ 7.0具有较好的稳定性。Co ²⁺对纤维素酶具有激活作用,Mg²⁺,Fe²⁺对纤维素酶具有抑制作用。     

玉簪属花药结构和花粉发育

利用石蜡切片技术研究了玉簪属植物花药结构和花粉发育,其观察结果表明：玉簪成熟花药由表层、药室内壁、中层和绒毡层等4层细胞组成;4个小孢子囊呈线形排列,并着生于药隔的向心面;小孢子母细胞分裂属连续型;成熟花粉为3-细胞结构,营养细胞充满大量淀粉粒;花药发育存在严重败育现象,花粉个体发育也具明显的不同步性;横切面观,玉簪花被片具有9～13个痕迹;2n=2x=60.从上述资料看,作者支持把“玉簪属”植物提升到“玉簪科”的水平.