鸡白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将鸡白细胞介素-2(ChIL-2)基因插入酵母分泌型表达载体pPIC9K 构建重组表达载体pPIC9K/ChIL-2,通过电转化构建毕赤酵母(Pichia methanolica)GS115 甲醇利用型重组表达菌株.经SDS-PAGE与Western blot分析,证实ChIL-2基因在重组GS115中成功表达出约16 ku与14 ku两条特异性条带,这与天然ChIL-2相对分子质量大小一致,提示ChIL-2可能为糖基化蛋白质.     

重组人源性抗HBsAg Fab抗体的特性分析

通过噬菌体展示技术从含高滴度抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体的人外周血淋巴细胞获得抗HBsAg Fab抗体的轻、重链基因．将Fab的轻、重链基因分别整合到巴斯德毕赤酵母(Pichua pastons)GS115菌株的染色体上，成功构建了高效分泌表达抗HBsAg Fab抗体的酵母工程菌．对酵母表达的重组Fab抗体进行了纯化，并对其相对分子质量、糖基化以及抗原结合能力等特性进行了分析，结果显示重组酵母分泌表达的重组人源性抗HBsAg Fab是一个相对分子质量为50000左右的低糖基化糖蛋白，1mg重组Fab抗体相当于40u的抗乙肝表面抗原抗体(20U／mg)．表明重组Fab抗体具有较强的结合HBsAg的能力．     

糖基化影响真菌植酸酶的胰蛋白酶耐受性

通过重叠聚合酶链式反应,将黑曲霉植酸酶(Aspergillus niger NRRL 3135phytase)第238~337位与第382~444位多肽片段的基因编码序列替换为烟曲霉植酸酶(Aspergillus fumigatus ATCC 13073phytase)中的对应序列,构建片段置换植酸酶(Fragments-replaced phytase)基因.将插入该基因的pGAPZαA重组质粒转化入毕赤酵母.通过离子交换与凝胶过滤纯化,获得重组酵母分泌的活性片段置换植酸酶.与黑曲霉植酸酶相比,片段置换显著提高了片段置换植酸酶的胰蛋白酶耐受性.而通过脱糖基化酶PNGase彻底去除N-糖基化,可恢复片段置换植酸酶对胰蛋白酶的敏感性.上述结果表明烟曲霉植酸酶对应片段上的N-糖基化修饰可显著提高毕赤酵母表达的黑曲霉植酸酶的胰蛋白酶耐受性.     

抗菌肽AD基因的改造及在毕赤酵母中的表达

采用PCR技术改造抗菌肽AD基因，将其C末端改造为Asn编码，改造后的抗菌肽Cecropin AD基因克隆到pPICZα－A载体上，构建成酵母重组分泌型表达载体，转化毕赤酵母（Pichia pastoris)受体菌GS115中，采用zerocin抗性标记筛选重组转化子，经摇瓶发酵，浓缩发酵液进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和抑菌活性检测。结果表明，改造后的Cecropin AD基因在毕赤酵母中获得了表达，表达产物经α－Factor信号肽引导分泌到胞外，具有较强的杀菌活性。     

PML-RARα和hGM-CSF双基因表达载体的构建

目的:构建急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARα基因与人粒巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因真核双表达载体,为利用DNA疫苗治疗APL奠定基础。方法:利用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增出PML-RARα融合点附近的部分基因片段,通过PCR从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因,并分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点(MCS)A和B中,构建真核双表达载体。利用酶切和序列分析方法验证所构建载体的正确性。结果:NheI/M luI和XbaI/SalI双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hGM-CSF基因,且序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。结论:成功构建了含有PML-RARα基因及hGM-CSF基因的真核双表达载体。     

酵母表达系统表达外源基因的研究进展

阐述了几种常用的酵母表达系统的研究现状及应用前景,并对酵母分泌的外源蛋白的含量及糖基化程度进行了比较．我们认为：甲醇营养型酵母分泌的外源蛋白量高且无过度糖基化现象,具有良好的应用前景     

蚯蚓纤溶酶7#组分基因在甲醇酵母中的克隆与表达

为了使蚯蚓纤溶酶(EFE)最佳活性组分EFE-7#基因在甲醇酵母(Pichia pastoris)中获得表达,构建了表达载体pPIC9K-EFE,通过对电击条件的优化,转化率达到5×103个/μg DNA.为了便于筛选阳性克隆,以该基因的原核表达产物为抗原免疫动物,获得了与天然EFE-7#组分具有相同免疫特异性的抗体.用该抗体为探针对上述转化子进行筛选,得到了上百株阳性重组子.RT-PCR和western blotting证明,EFE-7#基因在这些重组子中获得了表达,表达产物相对分子质量高于天然产物.     

Neuritin毕赤酵母分泌表达系统的构建

为构建Neuritin毕赤酵母分泌表达系统,进一步得到高纯度的具有天然活性的Neuritin蛋白提供实验基础。采用人工合成去除信号肽的neuritin基因并在N端引入His标签序列,两端引入Eco RⅠ和NotⅠ酶切位点,克隆至p PIC9K分泌型表达载体。重组质粒经PCR与测序鉴定正确后电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中,经MD平板与G418平板筛选阳性重组子,抽提毕赤酵母基因组PCR鉴定重组质粒的插入。结果显示,p PIC9K-neuritin重组质粒经测序鉴定完全正确,电转后成功插入毕赤酵母基因组中。由此可知,成功构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统。     

蜂毒肽类似物的基因表达与构效关系研究

根据先前建立的蜂毒肽QSAR模型预测，为获得溶血活性相对最低，保留或提高抑菌活性的蜂毒肽类似物。设计了六条蜂毒肽类似物基因，采用P. pastoris表达系统，通过构建 pPICZα-A-Mel重组质粒，电击转化酵母。以α-factor为分泌信号，在GS115中分泌表达。以MDH、MMH筛选，诱导培养，6×His亲和层析纯化表达产物, Tricine-SDS-PAGE电泳证实。新设计的六条类似物基因表达后抑菌活性与天然序列蜂毒肽相比，四条增强，两条减弱。类似物【C】抑菌效价(U)为1.29，是重组天然序列蜂毒肽的1.6倍左右，活性最强，而重组天然序列蜂毒肽为0.7977。类似物【C】溶血活性比天然序列蜂毒肽降低至1/25。类似物【B】的表达量最高，为0.31mg/mL，其抑菌活性仅次于【C】。两种类似物的溶血活性降低至天然序列蜂毒肽的1/25左右，两种降低至1/20左右，还有两种降低至1/15左右。对蜂毒肽分子结构的优化设计合理，达到了保留或提高抑菌活性，降低溶血活性的目的。     

蚯蚓纤溶酶(EFE-3D)基因的合成及其在毕赤酵母中的表达

选择毕赤酵母偏爱密码子,分成32个长约48 bp且相互配对的寡核苷酸片段,合成蚯蚓纤溶酶基因EFE-3D。寡核苷酸片段经5′磷酸化后,通过错位拼接,PCR(聚合酶链式反应)一次性完成新基因的合成并且克隆至载体pP IC 9K中。最后利用电穿孔法将新基因克隆至毕赤酵母表达系统并进行诱导表达,用免疫印记法检测表达产物,最后利用纤维平板确定其表达产物的活性为3 500 mm2/mL,1 L发酵液相当于48 m g天然蚯蚓纤溶酶活性。     

产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建

根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子,采用基因半合成技术合成人胰岛素基因.将合成的胰岛素基因克隆到pP IK 9质粒,构建了毕赤(P ich ia)酵母重组表达载体pP IN S319,用B g lⅡ线性化后用电转化法导入毕赤酵母G S ll5菌株,经过营养筛选和PCR复筛,得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株.经SDS-PAGR和密度扫描分析表明,合成的人胰岛素基因能够在毕赤酵母中高效分泌性表达,表达量可达0.563 m g/mL,表达产物无需转肽过程,只经过胰蛋白酶和羧肽酶B简单处理即得到优质重组人胰岛素,其体内活力约为30 IU/m g.     

毕赤酵母密码子用法对人骨形成蛋白6表达的影响分析

对已筛选出的毕赤酵母阳性转化子菌株（His＋Mut＋）和（His＋Muts）进行PCR验证,用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组骨形成蛋白6的表达情况,为了解释无表达的结果,对酵母的密码子与重组骨形成蛋白6的密码子兼容性进行了理论上的初步分析。     

酵母Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定

酵母Elp3是Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸.生物信息学分析及有关研究表明Elp3除组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)活性外,可能还拥有组蛋白去甲基化酶活性.本文以yElp3的pYES2yElp3质粒为模板,PCR获得yElp3基因全长,插入改造过的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析及G418筛选获Mut+型多拷贝整合菌,经0.5%的甲醇诱导和Ni-NTA纯化,得到目的蛋白并对其进行体外酶活测定.SDS-PAGE分析表明yElp3在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,Western印迹证实得到的蛋白为yElp3.OPA法测得纯化蛋白拥有较好的HAT活性,具有生物活性的Elp3蛋白的获得为体外测定其第二结构域是否有催化活性奠定了基础.     

人Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及HAT活性测定

人Elp3蛋白(human Elongator protein 3,hElp3)是组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸,其功能异常与人类多种疾病相关.目前对其羧基末端高度保守的第二功能域研究较少.以pYES2hElp3质粒为模板,PCR获hElp3基因全长,插入改造的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母菌GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析和G418筛选得到Mut+型多拷贝整合菌.0.5%的甲醇诱导hElp3高效分泌表达,Ni-NTA纯化及Western印迹证实获目的蛋白.OPA法测得其拥有良好的HAT活性,为体外测定其第二结构域是否拥有催化活性奠定了基础,对筛选抑制其HAT活性的小分子药物用于疾病治疗研究至关重要.     

芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

根据已知的枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得了长约1.1kb不含有信号肽序列的植酸酶phyC基因表达片段.经T载体克隆及序列测定后,构建毕赤巴斯德表达载体pPIC3.5K-phyC,并电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子,并进行了诱导表达.SDS-PAGE分析表明:表达产物分子量为42.01KD,表达量占细胞可溶性总蛋白的24%,并具有植酸酶的生物学活性.酶学性质分析结果显示:胞内表达的植酸酶酶促反应最适pH值为7.5;最适反应温度为70℃;经90℃处理10min,残留酶活性42% 均优于出发菌株天然植酸酶的相应性质.     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其在医学领域的应用

毕赤酵母表达系统是近几年在外源蛋白表达方面应用比较广泛的一套工具,到目前为止,已用这个系统成功表达了200多种来自病毒、细菌、真菌、动植物和人的蛋白,如人白介素、人血清白蛋白、乙肝表面抗原、水蛭素等。本文就巴斯德酵母细胞的基本特性、宿主菌及其质粒、影响外源蛋白表达的因素和在医学上的应用作一综述。     

新城疫病毒HN蛋白表达条件的优化、纯化及其活性鉴定

为提高HN蛋白在毕赤酵母中的表达水平,本研究从不同诱导时间、培养基不同pH、不同甲醇诱导剂量等因素对HN基因在毕赤酵母中的表达条件进行优化。按最适条件大量诱导表达,对表达产物进行纯化,并通过血凝试验检测其生物学活性。结果表明pPICZαA-HN／X-33在培养液pH6．0,2．0％甲醇浓度、诱导96h时为最优条件,HN蛋白的表达量最高,可达0．3mg／mL,并具有较好的生物学活性。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP3在Pichia.pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法克隆肠道病毒71型SHZH98株外壳蛋白VP3基因,连接T载体,经序列测定后,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP3,经序列测定证实-factor信号肽和VP3的序列和阅读框正确后,用SacI酶切使之线性化,电转化法将目的基因整合到宿主菌GS115基因组上;经转化子表型筛选和PCR分析鉴定后,甲醇诱导,筛选到5株高效表达VP3蛋白的工程菌株.ELISA实验表明:重组蛋白VP3具有较好的免疫原性.     

毕赤酵母表达风味强化肽的分离与纯化

为了开发新型风味强化剂,采用硫酸铵分段盐析法、中空纤维超滤、阴离子交换树脂分离等方法,对构建的工程菌P.,postoris GS115-16B2发酵表达的16拷贝风味强化肽的分离纯化效果进行研究.实验结果表明,分离纯化最佳方法为:首先使用中空纤维进行超滤浓缩,经过两次稀释过滤浓缩后的浓缩液再采用离子交换树脂DEAE–52进一步分离纯化.经SDS-PAGE检测,纯化后16拷贝风味强化肽的平均纯度可达93.19%.     

人胰岛素原密码子的优化及其在毕赤酵母中的表达

依据毕赤酵母偏好密码子,设计合成长效人胰岛素原( human proinsulin,HPI)基因序列,所合成的HPI基因全长为200 bp,并在其N端添加信号肽(EEAEAEAEPK)以提高目的蛋白表达.将改造后基因克隆到pPIC9K载体中,构建分泌表达型载体pPIC9K-HPI,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中.用遗传霉素G418梯度筛选获得高拷贝菌株,在甲醇诱导下表达分子质量为7.87 ku的HPI,利用金属螯合层析纯化蛋白质,胰蛋白酶酶切后利用人胰岛素试剂盒测得生物活性,HPI摇瓶最高产量可达35.4mg/L.该研究为获得大量长效胰岛素基因工程产品奠定研究基础.