白蚁肠道木质素分解菌PY12的分离鉴定及lip基因的克隆

利用苯胺蓝平板法从白蚁肠道中分离到一株木质素分解高效菌株PY 12,经形态观察、生化鉴定和16 SrRNA鉴定为肠杆菌属的霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei).根据已报道的lip(木质素过氧化物酶,Lignin Peroxidase)基因序列设计特异性引物,克隆该菌的lip基因,将其克隆入pMD19-T载体,获得的核苷酸序列为918 bp,并与GenBank中已知的lip序列进行同源性对比,同源性不高,但该核苷酸翻译后的氨基酸序列比对结果发现,其与假单胞杆菌Pseudomonas sp.编码蛋白质的氨基酸序列同源性为88.5%.     

甘薯类胡萝卜素合成酶基因pds全长cDNA的克隆

根据双子叶植物类胡萝卜素合成结构基因氨基酸保守区域设计简并引物,扩增出甘薯编码类胡萝卜素合成关键酶PDS的基因(pds)cDNA中间片断。通过5'-RACE和3'-RACE技术进行cDNA末端的快速扩增,成功地克隆了pds的全长cDNA。序列分析表明,pds基因的全长cDNA序列长度为2128 bp,编码572个氨基酸,与其他植物的序列高度同源。     

D-对羟基苯甘氨酸生产菌株的选育方法探讨

利用国际上通用的以底物--对羟基苯海因(HPH)为惟一氮源的培养基从69个土壤样品和3个水样中初步分离出238个菌株,然后利用双层琼脂法和微孔快速筛选法对分离到的菌株和实验室保藏的220多株茵进行反复筛选,最终获得D-海因酶阳性菌株54株.用茚三酮显色法及纸层析法从这54株茵中筛选到2株产N-氨甲酰水解酶的阳性菌株,从而获得了可同时产生D-海因酶(DHase)和D-氨甲酰水解酶(DCase)的菌株.     

产微球茎菌琼胶酶基因的克隆及生物信息学分析

以琼脂为唯一碳源的培养基分离出一株产琼胶酶的海洋菌株AG1,16S rRNA基因序列分析显示,该菌株为产微球茎菌（Microbulbifer sp.）。以菌株AG1的基因组为模板,使用琼胶酶特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pMD18-T载体后进行测序。结果显示,克隆基因的大小为1302 bp,预测编码含有433个氨基酸残基的蛋白质。对该蛋白质进行生物信息学分析,结果表明,该蛋白质序列与来自耐热微泡菌（Microbulbifer thermotolerans）的琼胶酶氨基酸序列相似性为100%,预测本研究克隆的基因编码琼胶酶。该琼胶酶的理论分子质量大小为48.2 ku,理论等电点为5.42。采用同源建模法建立Microbulbifer sp.AG1琼胶酶的三维结构,富含β-折叠。     

斜卧青霉P6木素过氧化物酶的褐煤降解活性及cDNA克隆

对纯化得到的斜卧青霉P6分泌的木素过氧化物酶的褐煤降解活性进行了研究,发现纯酶的褐煤降解活性依赖于 H₂O₂ 的激活。降解后产物中小分子黄腐酸含量显著提高,褐煤及降解产物的经验分子式分别为 C₁₀₀H_86.5O_36.5N_2.09 和 C₁₀₀H_103.9O_48.6N_11.4,降解产物比原褐煤具有更高的 H、O、N 含量,而 C 含量明显下降。并且降解产物可提高豌豆种子的发芽率并明显缩短发芽时间。根据 N 末端氨基酸序列设计特异性引物,利用 RT-PCR 方法扩增得到一条约 2000 bp 的 cDNA 片段,序列测定的大小为 1956 bp,通过序列比对,与已报道的 Piloderma croceum 菌的 mnp2 基因具有 45％ 的同源性,具有过氧化氢酶的保守氨基酸残基。     

高产5-氨基乙酰丙酸光合细菌株hemA基因的克隆与序列分析

对从不同生态环境中分离得到的20株光合细菌,进行5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)的产量检测,结果显示一株分离自广州市云溪公园池塘底泥的菌株R5,其5-ALA 产量最高,达4.92 mg/L.根据GenBank上公布的5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA基因序列,设计引物进行hemA基因的克隆.结果表明,菌株R5的hemA基因序列长1 230 bp, 不含HindⅢ酶切位点,G C为64.68%,编码一个409个氨基酸的酶蛋白,分子质量为44.9 ku,与Rhodopseudomonas palustris KUGB306菌株的hemA基因序列相似性为98.6%,氨基酸序列相似性为100%.系统发生树显示,菌株R5与Rhodopseudomonas palustris处在一个分支,显示菌株R5可能是Rhodopseudomonas palustris,这与微生物鉴定实验的结果一致.本研究克隆的高产5-氨基乙酰丙酸菌株的hemA基因,为后期获取高产5-ALA的基因工程菌打下基础.     

酿酒酵母中D-(-)-扁桃酸脱氢酶性质研究

采用DEAE Sepharose离子交换层析、Butyl Sepharose疏水层析和Blue Sepharose亲和层析等分离方法,从高产D-(-)-扁桃酸的酵母菌株BY1.1b中纯化得到电泳纯的D-(-)-扁桃酸脱氢酶.采用Sephacryl S-200分子筛层析柱测得该酶的相对分子质量约60 kDa,用SDS-PAGE电泳测得该酶亚基分子量为32 kDa,表明该酶属于同型二聚体.该酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.0.该酶在低于30℃,pH5.5~8.0较为稳定.以NADH和苯乙酮酸为底物,其Km值分别为Km(NADH)=99.2μmol/L和Km(苯乙酮酸)=263.3μmol/L.     

易错PCR法定向进化D-海因酶的初步研究

D-海因酶是生物转化D-型氨基酸的关键酶,在一定浓度M n2 存在下,经易错PCR法重复扩增,产物构建成pET-HDT重组子,并建立突变体文库.经筛选获得了内源DNA序列变异的变异株.进化酶催化底物海因水解的活性为亲本重组酶的1.3倍,催化底物对羟基苯海因水解的活性为亲本重组酶的2.4倍.     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的分离

以黑曲霉基因组DNA、mRNA为模板,利用种属相似性设计了一对引物,采用PCR与RT-PCR技术得到β-葡萄糖苷酶基因的DNA和cDNA全序列.测序表明:克隆得到的DNA序列全长2 924 bp,cDNA序列全长2 583 bp,编码860个氨基酸.编码序列推导的蛋白质序列相似性分析显示:完整蛋白质序列同源性高达97%～99%.该研究为β-葡萄糖苷酶基因的遗传转化及应用 奠定了基础.     

纤维素降解菌N2-10菌株β-1,4-内切葡聚糖酶基因的克隆及表达

为探究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N2-10菌株降解纤维素的机理,通过同源性比对设计兼并引物扩增菌株β-1,4-内切酶葡聚糖基因,并进行生物信息学分析,然后研究其在大肠杆菌中的表达情况.结果显示,该内切葡聚糖酶基因大小为1500bp,共编码499个氨基酸,具有典型的纤维素酶结构,SDSPAGE电泳检测其表观分子质量约为55ku;刚果红染色显示,表达产物具有纤维素酶活性.     

Cloning and expression of ophc2, a new organphosphorus hydrolase gene

The amino acid sequences of N-terminal and internal peptide of OPHC2, purified from Pseudomonas pseudoalcaligenes strain C2-1 in our lab, are determined. The full-length organphosphorus hydrolase gene ophc2 is cloned by PCR using the degenerate primers designed according to the sequences and future inverse PCR. The ophc2 gene is 975 bp long with G C content of 63%, comprising one open reading frame encoding a polypeptide of 324 amino acids with a molecular weight of 36 kD. The nucleotide sequence of ophc2 shows low homologies with those organphosphorus hydrolase genes deposited in GenBank, one of which exhibits the highest homology of 46.4% with ophc2. The organphosphorus hydrolase protein expressed in E. coli bears normal bioactivity.     

羊传染性脓疱病毒吉林分离株F1L基因的克隆与同源性分析

通过参考GenBank中羊传染性脓疱病毒的F1L基因序列设计引物, 应用PCR技术的特异性扩增了羊传染性脓疱病毒JLSY04株的F1L基因片段, 测序得到了该病毒F1L基因序列, 并与几个参考毒株序列进行比对. 实验结果表明, 羊传染性脓疱病毒JLSY04株与OV/Torino株同源性最低, 为96.0％, 与Jilin株同源性最高, 为99.4%. 即该羊传染性脓疱病毒JLSY04株F1L基因与其他参考毒株间的差异较小, 可作为基因工程疫苗的目的基因.     

获得四环素抗性的温敏同源重组载体质粒pRNT15的构建

 苏云金芽孢杆菌工程菌株TnX对蚊幼虫具有高毒力,但红霉素抗性基因的存在限制了其商品化。根据转座子Tn917载体的基因序列,利用重叠延伸PCR法克隆同源重组序列到pRN5101上得到pRN15,根据pBU4载体上的四环素抗性基因序列,对pRN15进行改造,使其失去红霉素抗性,获得四环素抗性,载体命名为pRNT15。重组载体四环素抗性的获得,使之扩大了使用范围,也为工程菌株染色体中红霉素抗性基因的敲除奠定了基础。     

PRV广东株gE基因去信号肽片段的克隆与序列测定

根据伪狂犬病病毒（PRV）Rice株gE基因的序列设计并合成了1对引物,以我国PRV地方毒株广东株的基因组DNA为模板,通过PCR方法获得了一大小约1.6kb的DNA片段,并将其克隆到pMD18-T载体上进行测序,序列测定结果显示,该片段长1665bp,编码555个氨基酸,与PRV Rice株gE基因的核苷酸序列同源性为97.7%,氨基酸序列同源性为95.9%。     

新疆绵羊种布鲁氏菌GroEL基因的克隆及序列分析

参考牛种布鲁氏菌的GroEL（热休克蛋白）基因设计引物,扩增出新疆绵羊种布鲁氏菌GroEL基因片段,将其片段克隆到T载体上测序。结果表明：新疆源布鲁氏菌GroEL基因片段长1641bp,编码546个氨基酸,与羊种（B．melitensis）、猪种（B．suis）以及牛种（B．abortus）GroEL基因的核苷酸序列同源性分别为99．88％、99．82％、99．88％,推导的氨基酸序列同源性在99％以上,显示了很强的保守性。     

嗜热菌EPT3硫酸酯酶基因的克隆及生物信息学分析

利用筛选培养基筛选到一株产硫酸酯酶的深海嗜热菌EPT3,通过16SrDNA分析,将该菌株归属为Geobacillussp．EPT3．以菌株EP＇13的基因组DNA为模板,使用硫酸酯酶引物进行PCR扩增,将目的基因克隆至pUCm—T载体后进行测序．测序结果表明,克隆基因的大小为1956bp,预测编码651个氨基酸残基．对该基因编码蛋白质进行了生物信息学分析,结果表明,该蛋白质序列与其他菌株来源的硫酸酯酶具有很高的相似性,提示本研究克隆的基因编码硫酸酯酶．该硫酸酯酶的理论分子质量为75．1ku,理论等电点为6．90．采用同源建模法建立了GeobaciUussp．EPT3硫酸酯酶的三维结构模型,为球状结构．     

Construction of cDNA library, nucleotide sequence and analysis of entire genome of classical swine fever virus strain Shimen

According to the previously published CSFV sequences, 18 pairs of primers have been designed and synthesized, which cover the entire genome of CSFV strain Shimen. Each cDNA fragment has been amplified by RT-PCR from the anticoagulant blood of strain Shimen infected pig. The PCR products have been cloned respectively and sequenced. Results show that the cDNA library of strain Shimen and its nucleotide sequence have been obtained. The genomic RNA of strain Shimen is 12 298 nucleotides in length, containing a 5' and a 3' noncoding region 373 and 231 nt long respectively. The center of genome is a single large open reading frame of 11 697 nt which encodes a polyprotein of 3 898 amino acids. The entire sequence of strain Shimen has also been compared with that of other CSFV strains.     

Construction of cDNA library, nucleotide sequence and analysis of entire genome of classical swine fever virus strain Shimen

According to the previously published CSFV sequences, 18 pairs of primers have been designed and synthesized, which cover the entire genome of CSFV strain Shimen. Each cDNA fragment has been amplified by RT-PCR from the anticoagulant blood of strain Shimen infected pig. The PCR products have been cloned respectively and sequenced. Results show that the cDNA library of strain Shimen and its nucleotide sequence have been obtained. The genomic RNA of strain Shimen is 12 298 nucleotides in length, containing a 5′ and a 3′ noncoding region 373 and 231 nt long respectively. The center of genome is a single large open reading frame of 11 697 nt which encodes a polyprotein of 3 898 amino acids. The entire sequence of strain Shimen has also been compared with that of other CSFV strains.     

LPA法克隆嗜盐菌Halobacterium species xz515古紫质基因

Halobacterium species xz515是从中国西藏分离到的嗜盐菌，所含古紫质(古细菌视紫红质的简称命名为AR4)具有与其他已知菌视紫红质相反的质子释放和吸收的顺序而引起重视．连接反应介导的PCR扩增法(LPA)是一种克隆部分序列已知的基因的新型克隆方法．LPA法利用“酶切-连接-PCR”之组合，首先选定一组限制性内切酶，各自单独地酶切细菌总DNA样品，然后酶切产物分别与相应的寡聚核苷酸片段接头连接．连接液混合起来，作为扩增未知序列DNA的模板．通过这种方法，克隆到了包括完整AR4基因开放阅读框和0．4kb上游调控区域的总长度1．3kb的DNA片段．实验结果表明LPA法可以代替传统的构建基因组DNA文库的方法，可以快速有效地获得目标基因相关的序列．